NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TỰ PHÂN (AUTOLYSIS) PROTEIN THỊT ĐỎ CÁ NGỪ

1. Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam là quốc gia có thế mạnh về xuất khẩu thủy sản, sản lượng thủy sản năm 2012 đạt 6,13 tỷ USD, trong năm 2013 – khảng 5,9 triệu tấn, … trong đó cá ngừ là một trong những mặt hàng chủ lực. Hiện nay, cả nước có hơn 100 doanh nghiệp chế biến cá ngừ với sản lượng nguyên liệu ước tính khoảng 91.356 tấn (số liệu tính tới tháng 6 của năm 2015). Theo ước tính của Hiệp hội chế biến cá ngừ (Vinatuna) sản lượng chế biến và tiêu thụ cá ngừ hàng năm có thể đạt 200.000 tấn, với kim ngạch xuất khẩu đạt trên 400 triệu USD/năm, là một trong những mặt hàng hải sản xuất khẩu chính của Việt Nam chỉ sau cá Tra và tôm [4]. Các sản phẩm xuất khẩu chủ lực là cá ngừ đông lạnh (sashima), cá ngừ đóng hộp dầm dầu, cá ngừ xông khói, xúc xích cá ngừ,…

Các phụ phẩm từ quy trình chế biến cá ngừ (đầu cá, xương cá, da cá, ruột cá, thịt đỏ, …) đã được xác định là nguồn protein quan trọng để sản xuất các mặt hàng có giá trị gia tăng. Nguồn phụ phẩm thịt đỏ cá ngừ bị loại bỏ chiếm 7-12% trọng lượng cá ngừ nguyên con, hiện nay chưa được quan tâm nghiên cứu để chế biến [3]. Trong khi đó, trong nước chưa có công trình nào nghiên cứu một cách bài bản và có hệ thống giải quyết vấn đề này tận thu được lượng protein giá trị từ thịt đỏ trong sản xuất cá ngừ để tạo ra các sản phẩm thực phẩm giá trị gia tăng.

Trong nhiều năm qua, các kĩ thuật đã được phát triển trong việc khai thác và thu hồi những sản phẩm có giá trị sinh học cao [21] như phân bón, thức ăn gia súc, thức ăn thủy sản. Ngoài ra, dịch thủy phân protein được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp [21]. Gần đây, dịch thủy phân protein từ các nguyên liệu thủy sản đã trở nên phổ biến trong ngành công nghiệp thực phẩm do hàm lượng protein cao [34]. Việc thủy phân protein làm giảm kích thước các peptide, dịch thủy phân là nguồn acid amin tự do, được sử dụng trực tiếp cho sinh tổng hợp protein [26]. Trong phương pháp hóa học, một số hóa chất được áp dụng để thủy phân phụ thủy sản, ví dụ HCl 1M, sodium sulfite, NaOH và KOH [26]. Tuy nhiên, việc sử dụng acid mạnh hoặc base mạnh để thủy phân protein là nguyên nhân tạo ra các sản phẩm phụ có tác hại với môi trường. Vì vậy, thực hiện thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ theo phương pháp enzyme có nhiều thuận lợi trong việc kiểm soát các quá trình thủy phân và do đó giảm thiểu các phản ứng không mong muốn, giảm ô nhiễm môi trường, tuy nhiên việc dùng enzyme thương mại hiện nay còn khá đắt đỏ dẫn tới chi phí sản xuất cao. Bên cạnh đó, quá trình này thủy phân protein có thể thực hiện bằng cách tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt động của protease/proteinase nội tại có trong thịt đỏ cá ngừ [10]. Bởi vì, người ta đã chứng minh, trong thịt đỏ cá ngừ, cathepsin – là một proteinase hoạt động trong môi trường acid, hoạt độ mạnh nhất đạt được ở pH=2,0-5,0. Cathepsin là một enzyme nội bào, có vai trò quan trọng trong quá trình tự phân hủy thịt và thủy hải sản, quá trình tự thủy phân diễn ra rất mạnh mẽ ở điều kiện thích hợp[14].

Từ những luận giải khoa học trên đây, mục tiêu của luận văn được đưa ra là nghiên cứu khả năng thủy phân thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme protease nội tại để thu dịch đạm và tinh chế. Từ đó, tìm giải pháp kĩ thuật để chế biến thịt đỏ cá ngừ để tạo ra sản phẩm có giá trị kinh tế, có thể góp phần làm giảm hao tổn nguyên liệu cá ngừ sau thu hoạch.

2. Mục đích nghiên cứu

Đề tài được tiến hành nhằm các mục đích sau đây:

– Xác định được khối lượng và thành phần hóa học thịt đỏ cá ngừ.

– Nghiên cứu quá trình bất hoạt vi sinh vật trong mẫu nguyên liệu bằng phương pháp vật lí và hóa học

– Khảo sát mức độ thủy phân protein trong nguyên liệu dưới tác dụng của các hệ enzyme calpain, cathepsin và collagenase

– Đề xuất quy trình công nghệ thu hồi dịch đạm từ thịt đỏ cá ngừ trên cơ sở kích hoạt hệ enzyme protease nội tại

– Đánh giá chất lượng dịch đạm từ cơ thịt đỏ cá ngừ để định hướng sử dụng.

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1. Đối tượng nghiên cứu:

– Cá ngừ ồ, cá ngừ sọc dưa và cá ngừ mắt to được thu mua từ Cảng Cá Thọ Quang, TP. Đà Nẵng được dùng để xác định khối lượng thịt đỏ.

– Hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ được lấy mẫu từ nhà máy đồ hộp Hạ Long, Đà Nẵng. Nguyên liệu được xay nhỏ bằng máy xay (Luxta, Việt Nam) và lựa chọn bằng sàng phân loại có đường kính lỗ sàng 3,0 – 3,5 mm. Sau đó, nguyên liệu được chia nhỏ thành từng khối (100 gram/khối) và lưu trữ ở -20°C ± 2°C phục vụ nghiên cứu.

3.2. Phạm vi nghiên cứu

– Sử dụng thịt đỏ cá ngừ thu mua ở thành phố Đà Nẵng làm cơ chất để nghiên cứu phản ứng tự thủy phân dưới xúc tác của enzyme protease nội tại.

– Nghiên cứu sẽ được thực hiện ở quy mô PTN

4. Phương pháp nghiên cứu

4.1. Phương pháp vật lý

Xác định nhiệt độ bảo quản, rã đông nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ. Xác định nhiệt độ tiến hành phản ứng tự thủy phân và nhiệt độ bất hoạt enzyme và vi sinh vật sau phản ứng

4.2. Phương pháp hóa lý

Xác định độ pH hỗn hợp nguyên liệu trước phản ứng, pH của hỗn hợp phản ứng và pH của dịch đạm thu được sau phản ứng tự thủy phân protein.

4.2.1. Phương pháp hóa sinh

– Xác định hàm lượng protein

– Xác định hàm lượng lipid

– Xác định hàm lượng nước

– Xác định hàm lượng tro

– Xác định hàm lượng ni-tơ amin

– Xác định thành phần và hàm lượng acid amin của dịch đạm thủy phân

4.2.2. Phương pháp vi sinh

– Xác định mối nguy lây nhiễm vi sinh vật có hại trong dịch đạm thủy phân

4.2.3. Phương pháp xử lý số liệu

– Kết quả thí nghiệm và độ lệch chuẩn (SD) được xử lý và tính toán bằng chương trình Microsoft Excel 2010.

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu

5.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài

– Làm cơ sở khoa học cho việc định hướng khai thác và sử dụng hiệu quả nguồn thịt đỏ cá ngừ để sản xuất các sản phẩm giá trị gia tăng như dịch đạm, bột đạm dinh dưỡng tại địa bàn Quảng Nam – Đà Nẵng

– Xác định điều kiện thích hợp để thu nhận được dịch thủy phân protein từ thịt đỏ cá ngừ đạt yêu cầu về chất lượng.

5.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

– Tận dụng nguồn nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ từ các nhà máy, công ty chế biến thủy sản trên địa bàn thành phố Đà Nẵng để sản xuất các sản phẩm giá trị gia tăng, nhằm tăng doanh thu cho các doanh nghiệp chế biến cá ngừ.

– Quy trình thu hồi dịch thủy phân protein từ thịt đỏ cá ngừ dễ áp dụng trong thực tiễn để chuyển giao cho các công ty hoạt động trong lĩnh vực chế biến cá ngừ có nhu cầu

6. Bố cục của luận văn

Luận văn gồm những chương mục sau:

Mở đầu

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Kết luận và kiến nghị

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về dịch thủy phân protein

Xét theo khía cạnh công nghệ, bột gia dinh dưỡng có thể được sản xuất bằng cách cô đặc và sấy khô dịch đạm thủy phân, do đó chất lượng chất lượng phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng dịch đạm thủy phân. Gần đây, dịch đạm thủy phân (DPH) từ các nguyên liệu thủy sản đã dần trở nên phổ biến trong ngành công nghiệp thực phẩm nhờ giá trị dinh dưỡng cao (Trần Thị Bích Thủy và cs, 2015) do quá trình thủy phân làm giảm kích thước protein và tạo ra các peptide, axit amin giúp cơ thể sinh vật dễ dàng sử dụng để sinh tổng hợp protein (Herpendi et al, 2011). Hai phương pháp được ứng dụng phổ biến hiện nay để sản xuất dịch đạm thủy phân là phương pháp hóa học và phương pháp sinh học. Phương pháp hóa học sử dụng một số hóa chất thủy phân phụ phẩm thủy sản chứa protein, ví dụ HCl 1M, sodium sulfite, NaOH, KOH,…So với phương pháp hóa học, phương pháp sinh học (sử dụng enzym thủy phân) có nhiều ưu thế hơn (Herpendi et al, 2011).

1.2. Giới thiệu về nguồn nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ

Nhiều nhà khoa học đã chứng minh, cơ thịt đỏ cá ngừ rất thích hợp dùng làm nguồn nguyên liệu để sản xuất bột gia vị dinh dưỡng. Theo nghiên cứu đánh giá của Viện Nghiên cứu Hải sản Ấn Độ, cơ thịt đỏ cá ngừ chứa 26-28% protein, 4-5% chất béo, tro khoảng 1%, thịt đỏ cá ngừ chứa hầu hết các axit amin thiết yếu đối với sự phát triển và duy trì các mô cơ, axit amin thiết yếu chiếm 49-52% tổng lượng axit amin, còn axit béo không bão hòa đa nối đôi chiếm 65% tổng lượng axit béo. Sự khác biệt của cơ thịt đỏ sao với thịt trắng ở chỗ, cơ thịt đỏ chứa hàm lượng glycogen, lipid, mioglobin, sắt (75% sắt không phải của Hem) và chytocrome C cao hơn trong cơ thịt trắng.

1.3. Tổng quan về enzyme nội tại

– Hệ enzyme protease quan trọng nhất là cathepsin (là enzyme thủy phân nằm trong lysosome). Lysosome chứa ít nhất 13 loại cathepsin bao gồm cathepsin A, B, C, D, H và L. Trong số này enzyme cathepsin quan trọng nhất là cathepsin D tham gia vào quá trình thủy phân protein nội tại của tế bào tạo thành peptide.

– Hệ enzyme protease calpain bao gồm µ-calpain, m-calpain và chất ức chế nội sinh calpastatin. Vai trò của calpain trong quá trình tự thủy phân của thịt cơ giống như các loại protease khác, calpain có khả năng phân cắt các protein cả trong ống nghiệm lẫn trong cơ thể sống

– Collagenase là enzyme có khả năng thủy phân liên kết peptit dạng poly-L như prolin đặc trưng trong vùng xoắn của collagen ở trạng thái tự nhiên của cơ chất không biến tính. Trong khi đó, các protein khác có thủy phân hạn chế collagen tự nhiên nhưng chỉ tại phần cuối của chuỗi xoắn có ở ngoài vùng xoắn đặc trưng của collagen, không có khả năng tấn công các liên kết trong vùng xoắn của collagen [16].

1.4. Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tự phân

– Trong một phạm vi nhiệt độ nhất định, tốc độ của phản ứng tăng lên cùng với sự tăng của nhiệt độ. Nhưng khi vượt quá phạm vi nào đó, các phản ứng được enzyme xúc tác bị ảnh hưởng do sự biến tính của phân tử protein-enzyme. Nhiệt độ 30-45⁰C thích hợp cho quá trình thủy phân thịt đỏ cá ngừ [8].

– Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm thay đổi tính chất của trung tâm liên kết cơ chất và hoạt động ở phân tử enzyme. Dẫn đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH. Như vậy enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường.

– Muối là nguyên liệu quan trọng trong quá trình thủy phân. Lượng muối quá cao thì sẽ gây ức chế hoạt động của enzyme (5%) [1].

– Muốn phản ứng xảy ra nhanh phải có sự tiếp xúc tốt giữa enzyme và cơ chất. Trong nghiên cứu này nhóm nghiên cứu tiến hành xay cá trước rồi tiến hành siêu âm cho hiệu quả tốt nhất.

– Cá tươi chế biến chất lượng tốt hơn cá ươn [10]. Cá ươn chứa nhiều vi sinh vật gây thối hơn cá tươi, khi phản ứng thủy phân xảy ra vi sinh vật gây thối hoạt động nhiều làm cho dịch thủy phân có màu đen, mùi hôi không mong muốn [10].

1.5. Lịch sử vấn đề nghiên cứu

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TỰ PHÂN (AUTOLYSIS) PROTEIN THỊT ĐỎ CÁ NGỪ — NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TỰ PHÂN
(AUTOLYSIS) PROTEIN THỊT ĐỎ CÁ NGỪ

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

– Cá ngừ ồ, cá ngừ sọc dưa và cá ngừ mắt to tươi, nguyên con được thu mua từ Cảng Cá Thọ Quang, TP. Đà Nẵng được dùng để xác định khối lượng thịt đỏ.

– Hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ được lấy mẫu từ nhà máy đồ hộp Hạ Long, Đà Nẵng, nguyên liệu được giữ lạnh và vận chuyển trong thùng xốp cách nhiệt về phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học – Trường ĐH Bách khoa, ĐH Đà Nẵng.

2.2. Dụng cụ và máy móc thiết bị

Sử dụng các thiết bị có trong phòng thí nghệm Công nghệ sinh học của trường Đại học Bách khoa – Đại học Đà Nẵng:

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp vật lý

Xác định nhiệt độ: sử dụng nhiệt kế kiểm tra nhiệt độ trong quá trình thực hiện phản ứng enzyme và bất hoạt enzyme

2.3.2. Phương pháp hóa lý

Xác định độ pH: Sử dụng máy đo pH để bàn TOLEDO MP220 – Thụy Sĩ thông qua điện cực đầu thủy tinh để xác định độ pH của nguyên liệu và dung dịch enzyme.

2.3.3. Phương pháp hóa sinh

2.3.3.1 Xác định hàm lượng protein

– Phương pháp xác định hàm lượng nitơ tổng số và protein thô trong thực phẩm được thực hiện theo phương pháp Kjeldahl (NMKL No.6, 4th 2003)

2.3.3.2. Xác định hàm lượng lipid

– Phương pháp xác định hàm lượng chất béo tổng số trong thực phẩm được thực hiện theo phương pháp chiết Soxhlet (NMKL số 131, 1989)

2.3.3.3. Xác định hàm lượng nước

– Phương pháp xác định hàm lượng ẩm theo tiêu chuẩn NMKL số 23 – 1991

2.3.3.4. Xác định hàm lượng tro

– Phương pháp kiểm tra hàm lượng tro theo tiêu chuẩn NMKL số 173-2005

2.3.3.5. Xác định hàm lượng histamin

– Phương pháp: xác định hàm lượng Histamin trong thuỷ sản và sản phẩm thuỷ sản theo tiêu chuẩn AOAC 977.13-2007

2.3.3.6. Xác định hàm lượng ni-tơ acid amin

– Phương pháp: xác định hàm lượng nitơ acid amin đối với các nguyên liệu, bán thành phẩm và sản phẩm thuỷ sản bằng phương pháp chuẩn độ foocmon theo tiêu chuẩn TCVN 3707-90

2.3.3.7. Xác định mức độ thủy phân (DH).

Trong đó:

: hàm lượng nitơ amino acid trong dịch đạm thủy phân (%);

: hàm lượng nitơ amino acid trong nguyên liệu trước khi thủy phân (%);

: hàm lượng nitơ tổng trong nguyên liệu ban đầu (%) .

2.3.4. Phương pháp vi sinh

2.3.4.1. Định lượng tổng số vi sinh vật

– Phương pháp: đếm khuẩn lạc theo tiêu chuẩn TCVN 4884 : 2005.

2.3.4.2. Định tính Salmonella

– Phương pháp: NMKL 71 5^th ed. 1999

2.3.4.3. Định lượng Staphylococus

Phương pháp: NMKL 66 4^th ed. 2003

2.3.5. Phương pháp cảm quan

Dùng các phép thử cảm quan để đánh giá chất lượng của dịch thủy phân.

2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu

– Số liệu được xử lý và tính toán trên phần mềm Microsoft Office Excel 2010 (giá trị của p < 0,05 được xem là có ý nghĩa về mặt thống kê)

2.4. Khảo sát thực nghiệm

2.4.1. Xác định thành phần khối lượng các cơ quan của cá ngử ồ

Cá ngừ ồ, cá ngừ sọc dưa, cá ngừ mắt to sau khi thu mua về được tách fillet và các thành phần khác và đem đi cân để xác định tỷ lệ các thành phần

2.4.2. Xác định thành phần hóa học của hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ được thu gom từ nhà máy

Mẫu thịt đỏ cá ngừ là hỗn hợp thịt đỏ các loại cá ngừ được thu gom từ Công ty CP Đồ hộp Hạ Long (Đà Nẵng) được phân tích thành phần hóa học thông qua các chỉ tiêu: hàm lượng protein, lipid, nước, tro và histamin.

2.4.3. Nghiên cứu quá trình bất hoạt vi sinh vật trong mẫu nguyên liệu bằng phương pháp vật lí và hóa học

Mẫu nguyên liệu thịt đỏ được chia ra thành các bao ni lông có khối lượng mẫu là 250 gr/một bao. Và được bổ sung các chất bảo quản lần lượt là Kali Sorbat, Natri benzoat, Muối ăn, xử lý bằng tia UV, và mẫu đối chứng (không sử dụng các yếu tố để bảo quản), sau đó được bảo quản ở điều kiện -20±2⁰C. Mẫu được lựa chọn là mẫu có lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí ở mức thấp nhất so với các mẫu còn lại.

2.4.4. Khảo sát mức độ hoạt động của các hệ enzyme calpain, cathepsin và collagenase trong nguyên liệu hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ

– Mục đích: Xác định được mức độ thủy phân protein của hỗn hợp nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ dưới tác dụng của 3 hệ enzyme Calpain, Cathepsin, Collagenase.

Nguyên liệu được rã đông, phối trộn với nước theo tỷ lệ 1:1, sau đó mẫu được xử lý siêu âm trong 15 mẫu để phá vỡ tế bào và bất hoạt vi sinh vật có trong mẫu.

Các thông số phản ứng được lựa chọn dựa trên những nghiên cứu của các nhà khoa học đã công bố, cụ thể: đối với hệ enzyme enzyme calpain: tỷ lệ nước:nguyên liệu là 1:1; pH = 7,0 ÷ 7,5; nhiệt độ: 35⁰C; thời gian phản ứng 120 phút [41]; Đối với hệ enzyme cathepsin: tỷ lệ nước:nguyên liệu là 1:1; pH: 4,0 ÷ 5,0; nhiệt độ: 45⁰C; thời gian: 120 phút [30]; Đối với hệ enzyme collagenase: tỷ lệ nước:nguyên liệu là 1:1; pH: 7,0÷7,5; nhiệt độ: 40⁰C; thời gian phản ứng 120 phút [44].

Sau quá trình phản ứng các mẫu được bất hoạt ở nhiệt độ t=95±2⁰C [6] và sau đó để nguội và đem đi đánh giá mức độ thủy phân (H) và độ tích tụ ni-tơ amin trong dịch đạm.

2.4.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tự thủy phân thịt đỏ cá ngừ dưới tác dụng của enzyme cathepsin.

Sau khi đã xác định được hệ enzyme nội tại mạnh nhất trong cơ thịt đỏ cá ngừ là cathepsin, nhóm nghiên cứu tiến hành loạt thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng tự phân (phản ứng enzyme) như tỷ lệ phối trộn nguyên liệu với nước, pH môi trường phản ứng, thời gian phản ứng. Phản ứng enzyme được tiến hành trên máy lắc ổn nhiệt STUART SI500 (Anh)

– Để xác định tỷ lệ phối trộn thích hợp giữa nước và nguyên liệu theo khối lượng cho phản ứng tự phân, các mẫu thí nghiệm được tiến hành với tỷ lệ nước: nguyên liệu (w:w) là 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, mô hình thí nghiệm này được lựa chọn dựa trên nghiên cứu của Bùi Trường Bích Ngân (2013) [10]. Các thông số khác của phản ứng tự phân được cố định ở nhiệt độ 45⁰C, pH = 4÷5 là pH tối ưu của cathepsine, thời gian tiến hành thủy phân là 4 giờ; Để xác định ảnh hưởng của pH môi trường lên quá trình tự phân, nhóm nghiên cứu đã tiến loạt thí nghiệm với độ pH khác nhau là 3, 4, 5, 6. Các thông số khác của phản ứng tự phân được cố định ở nhiệt độ 45⁰C, thời gian phản ứng là 4 giờ, tỷ lệ phối trộn nước:nguyên liệu xác định được từ loạt thí nghiệm đã tiến hành trước là 2:1; tiến hành xác định thời gian thích hợp cho quá trình tự phân bằng loạt thí nghiệm với thời gian thủy phân khác nhau là 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ, 7 giờ. Các thông số khác của phản ứng tự phân được cố định ở nhiệt độ 45⁰C, tỷ lệ phối trộn nước: nguyên liệu là 2:1, pH=5,0. Các thông số của phản ứng được xác định dựa trên độ tích tụ ni-tơ acid amin trong dịch đạm sau quá trình thủy phân

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả xác định thành phần khối lượng các cơ quan của một số loại cá ngừ ở khu vực Đà Nẵng

Bảng 3.1 Trình bày kết quả xác định thành phần khối lượng các cơ quan của cá ngừ ồ, cá ngừ sọc dưa và cá ngừ mắt to khai thác ở khu vực Đà Nẵng

Bảng 3.1. Thành phần khối lượng các cơ quan của một số loại cá ngừ

STT	Phần trăm khối lượng các cơ quan so với trọng lượng cơ thể, %
STT	Đầu	Xương		Ruột	Fillet	Thịt đỏ	Da, vây
Cá ngừ ồ	21±0,1		12±0,5	8±0,01	38±0,1	9.0±0,3	12±0,3
Cá ngừ sọc dưa	23±0,21		9±0,3	9±0,1	39±0.6	12±0,1	8±0,15
Cá ngừ mắt to	22±0,13		13±0,1	7.5±0,7	37±0,5	10.5±0,28	10±0,4

Phân tích kết quả từ bảng 3.1 nhận thấy rằng, tỷ lệ thịt đỏ trong cá ngừ mang đi phân tích dao động trong khoảng từ 9,0 đến 12%, cá ngừ sọc dưa có tỷ lệ thịt đỏ cao nhất trong 3 mẫu phân tích, chiếm 12%, cá ngừ ồ có tỷ lệ thịt đỏ thấp nhất, chiếm 9,0%, còn lại cá ngừ mắt to có tỷ lệ thịt đỏ chiếm 10,5% trọng lượng cơ thể.

3.2. Kết quả xác định thành phần hóa học của hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ thu gom từ nhà máy chế biến thủy sản

Hình 3.1. Thành phần hóa học cơ bản của hỗn hợp nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ

Hình 3.1 cho thấy mẫu hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ chứa hàm lượng protein tổng số cao (24%), giá trị này tương đương hoặc cao hơn so với hàm lượng protein trong một số loài cá ở một số nghiên cứu khác ví như cá trích là 19,25% [11], hay so với nghiên cứu của Bruce, 1924, hay Shigeo, 1958 thì cao hơn so với mực (17-21%); hàm lượng lipid thấp (0,53%), nên được xếp vào loại nguyên liệu (cá) gầy rất thích hợp cho việc sản xuất dịch đạm thủy phân.

3.3. Kết quả nghiên cứu bất hoạt vi sinh vật trong mẫu nguyên liệu bằng phương pháp vật lí và hóa học

Hình 3.2 Trình bày kết quả khảo sát số lượng vi sinh vật tồn tại trong mẫu dưới tác dụng của các tác nhân vật lý và hóa học.

Hình 3.2. Ảnh hưởng của các tác nhân vật lí và hóa học lên số lượng vi sinh vật trong mẫu nguyên liệu

Phân tích các đường biểu đồ nhận thấy, việc sử dụng các chất bảo quản có tác dụng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Cụ thể, đối với mẫu đối chứng không dùng chất bảo quản, số lượng vi sinh vật luôn ở mức cao, dao động ở mức 3500-4500 CFU/g trong suốt 7 tuần bảo quản. Mẫu nguyên liệu bảo quản bằng muối ăn có số lượng VSV ở mức trung bình so với các mẫu còn lại, dao động ở mức 2000-2500 CFU/g mẫu. Đối với mẫu xử lý bằng tia UV giai đoạn đầu số lượng VSV giảm rõ rệt, nhưng sau đó lại tăng, nguyên nhân là việc xử lý bằng tia UV không có tác dụng kéo dài, vì vậy số lượng VSV tăng nhanh từ tháng thứ 4 trong quá trình bảo quản, dao động ở mức 1000-3500 CFU/g nguyên liệu. Hai mẫu bảo quản bằng kali sorbat và natri sorbat có tác dụng ức chế sự phát triển của vi sinh vật rõ rệt nhất, tổng số lượng VSV luôn bị hạn chế dưới mức 2000 CFU/g trong suốt quá trình bảo quản, trong đó việc sử dụng chất bảo quản là kali sorbart có tác dụng rõ rệt và mạnh nhất trong sự ức chế vi sinh vật phát triển.

Từ những thông số trên, nhóm nghiên cứu sử dụng chất bảo quản là kali sorbate cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.4. Kết quả khảo sát mức độ thủy phân protein trong nguyên liệu dưới tác dụng của các hệ enzyme calpain, cathepsin và collagenase

Hình 3.3 và 3.4 trình bày kết quả khảo sát độ tích tụ ni-tơ acid amin và mức độ thủy phân protein trong quá trình kích hoạt các điều kiện hoạt động tối ưu của các hệ enzyme nội tại là cathepsine, calpain và collagenase.

Hình 3.3. Độ tích tụ nitơ acid amin trong dịch đạm thu được sau quá trình tự thủy phân dưới tác dụng của các hệ enzyme cathepsin, calpain và collagenase

Hình 3.4. Mức độ thủy phân protein trong dịch đạm thu được sau quá trình tự thủy phân dưới tác dụng của các hệ enzyme cathepsin, calpain và collagenase

Kết quả phân tích đồ thị trên hình 3.3 cho thấy, độ tích tụ nitơ acid amin trong dịch đạm thu được sau phản ứng tự phân hủy của cathepsine là cao nhất so với 2 mẫu khảo sát còn lại dưới tác dụng của hệ enzyme calpain và collagenase, cụ thể, độ tích tụ nitơ acid amin ở mức 0,64%. Độ tích tụ nitơ acid amin của cả 03 mẫu ở mức tương đối thấp (0,43÷0,64%) có thể do tính đặc đặc hiệu của các hệ enzyme, phân cắt theo cơ chế endo- mạnh hơn exo-. Phân tích các số liệu trên đây, nhóm nghiên cứu đi tới kết luận, hệ enzyme cathepsine trong nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ hoạt động mạnh nhất, và điều này phù hợp với những nghiên cứu trước đây (Aoki et al., 2004; Pangkey et al., 2000).

Để kiểm chứng kết quả khảo sát trên đây nhóm nghiên cứu đã tiến hành khảo sát hoạt độ hệ enzyme protease của nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ ở các vùng pH khác nhau của môi trường. Kết quả khảo sát được trình bày trên đồ thị hình 3.5.

Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH môi trường lên hoạt độ hệ enzyme protease trong thịt đỏ cá ngừ

Phân tích kết quả nghiên cứu trên đồ thị hình 3.5 cho thấy, hoạt độ protease đạt mức cao nhất ở vùng pH=4÷5 dao động ở mức 0,075 đến 0,085 UI/g nguyên liệu. Vùng pH này phù hợp với khảo sát trên hệ enzyme cathepsin (hình 3.3 và 3.4). Từ những phân tích và luận giải trên đây, nghiên cứu đi đến kết luận quá trình tự thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ xảy ra chủ yếu dưới tác dụng của hệ enzyme cathepsin. Từ cơ sở đó, nghiên cứu tiếp tục khảo sát các yếu tố liên quan đến quá trình kích hoạt hệ enzyme cathepsin, nhằm xác định khả năng ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình tự phân ở hỗn hợp nguyên liệu cơ thịt đỏ cá ngừ như: tỷ lệ phối trộn nguyên liêu: nước, pH môi trường phản ứng, thời gian phản ứng.

3.5. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tự thủy phân (autolysis) thịt đỏ cá ngừ dưới tác dụng của enzyme cathepsin

3.5.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn nguyên liệu: nước

Sản phẩm của phản ứng thủy phân protein dưới tác dụng của enzyme là các peptid có khối lượng phân tử nhỏ và các acid amin tự do, vì vậy nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước thường đánh giá mức độ phân cắt protein của phản ứng enzyme thông qua độ tích tụ nitơ acid amin trong dịch đạm thủy phân thu được sau phản ứng [2]

Hình 3.6. Sự phụ thuộc của độ tích tụ nitơ acid amin của dịch đạm thủy phân vào tỷ lệ phối trộn nguyên liệu: nước

Phân tích kết quả nghiên cứu ở hình 3.6 cho thấy độ tích tụ nitơ acid amin giảm khi tăng tỷ lệ nước trong hỗn hợp phản ứng. Độ tích tụ nitơ acid amin cao nhất ở mẫu có tỷ lệ phối trộn nguyên liệu: nước là 1:2. So sánh với kết quả nghiên cứu ở phần 3.2, trong trường hợp này độ tích tụ nitơ acid amin cao nhất ở mẫu với tỷ lệ phối trộn là 1:2 chỉ đạt mức 0,09% (hình 4), thấp hơn so với mẫu được tiến hành với tỷ lệ phối trộn nguyên liệu:nước là 1:1 đạt mức 0,64% ở cùng điều kiện phản ứng (hình 3.3). Tuy nhiên, khi so sánh chỉ tiêu cảm quan của dịch thủy phân sau khi lọc nhận thấy, mẫu tiến hành với tỷ lệ phối trộn nguyên liệu:nước là 1:2 có nhiều ưu điểm hơn như độ đồng nhất cao, dịch có màu vàng và mùi vị đặc trưng. Ở các mẫu được tiến hành với tỷ lệ nước cao hơn, quá trình lọc sau phản ứng thủy phân được tiến hành đễ dàng hơn, nhưng do hàm lượng nước rất lớn sẽ gây khó khăn cho việc cô đặc và sấy dịch đạm để thu bột đạm.

3.5.2. Ảnh hưởng của pH môi trường

Phân tích kết quả nghiên cứu sự thay đổi độ tích tụ nitơ acid amin của dịch đạm thủy phân ở các mức pH môi trường phản ứng khác nhau ở hình 3.7 cho thấy, độ tích tụ nitơ acid amin tăng từ 0,031 đến 0,05% khi pH tăng từ pH=3,0 đến pH=5,0 và đạt giá trị cực đại tại pH= 5,0 đạt mức 0,05%, nhưng nếu tiếp tục tăng pH lên mức pH=6,0 thì độ tích tụ nitơ acid amin không tăng mà giảm đi.

Hình 3.7. Sự thay đổi độ tích tụ nitơ acid amin của dịch đạm thủy phân ở các mức pH môi trường phản ứng khác nhau

Theo nghiên cứu của Aoki và cộng sự năm 2004 [15], thì vùng pH hoạt động của hệ enzyme cathepsine của đại đa số thủy hải sản nằm trong khoảng pH=3,0÷5,0, và mạnh nhất ở pH=5,0, có thể hoạt động đến mức pH=7,0 nhưng hoạt độ rất yếu. Như vậy, nhóm nghiên cứu xác định được độ tích tụ nitơ acid amin cao nhất ở mẫu được tiến hành ở pH=5,0 là phù hợp với kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học trước đây, và đi đến kết luận chọn pH môi trường phản ứng là pH=5,0 để tiến hành phản ứng tự phân hủy thịt đỏ cá ngừ.

3.5.3. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng

Hình 3.8. Sự phụ thuộc của độ tích tụ nitơ acid amin trong dịch đạm thủy phân vào thời gian phản ứng

Kết quả nghiên cứu ở hình 3.8 cho thấy, độ tích tụ nitơ acid amin tăng nhanh khi thời gian phản ứng tăng và đạt đạt giá trị cao nhất ở mẫu được tiến hành trong 7,0 giờ. Từ đồ thị hình 6 cho thấy, độ tích tụ nitơ acid amin cao nhất ở mẫu được tiến hành trong 6,0 và 7,0 giờ, tương đương nhau ở mức 0,099% và 0,103% nhưng dựa vào tính kinh tế nhóm nghiên cứu chọn thời gian 6,0 giờ là thời gian tiến hành phản ứng thích hợp cho quá trình tự phân protein cơ thịt đỏ cá ngừ vì khi kéo dài thời gian thủy phân vừa làm tăng chi phí sản xuất và các chỉ tiêu về mặt cảm quan của dịch đạm có thể bị ảnh hưởng.Vì vậy, dựa vào tính kinh tế ta chọn thời gian 6 giờ làm thời gian thích hợp cho quá trình tự phân protein.

3.6. Kết quả thí nghiệm kiếm chứng sản xuất thử dịch đạm

Hình 3.9. Mẫu dịch sản phẩm đạm thủy phân (a –mẫu chưa ly tâm; b-mẫu sau ly tâm)

Sau loạt thí nghiệm khảo sát đơn biến các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tự phân protein cơ thịt đỏ cá ngừ dưới tác dụng của enzyme cathepsine, để kiểm chứng nhóm nghiên cứu tiến hành thu mẫu điều kiện tối ưu xác định được là tỷ lệ phối trộn nguyên liệu:nước bằng 1:2, pH môi trường phản ứng là pH=5,0, thời gian phản ứng 6,0 giờ, nhiệt độ phản ứng t=45⁰C.

Mẫu dịch đạm thủy phân thu được trước khi ly tâm và sau khi ly tâm được mô tả trên hình 3.9. Mẫu dịch đạm sau khi ly tâm (hình 3.9b) ở dạng lỏng đồng nhất, có màu nâu vàng và mùi đặc trưng của dịch đạm thủy phân cá ngừ.

3.7. Đề xuất quy trình công nghệ thu hồi dịch đạm từ thịt đỏ cá ngừ trên cở sở kích hoạt hệ enzyme nội tại

3.7.1. Nguyên vật liệu

Nguyên liệu chính: hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ.

3.7.2. Sơ đồ quy trình công nghệ

Quy trình thu hồi và tinh chế dịch đạm từ thịt đỏ cá ngừ dự kiến như sơ đồ trên hình 3.10

Hình 3.10. Quy trình công nghệ thu nhận dịch đạm từ thịt đỏ cá ngừ bằng phản ứng tự thủy phân protein

3.7.3. Thuyết minh quy trình công nghệ

Thông số của các công đoạn cơ bản trong quy trình công nghệ được rút ra từ kết quả khảo sát. Ngoài ra, thông số của các công đoạn tinh chế và tạo sản phẩm được tham khảo từ công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trong và ngoài nước như Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng (1996) [7], Shironina (2015) [35], Ali Bougatef (2012)[17],…

3.7.3.1. Siêu âm phá mẫu

Mẫu nguyên liệu đã xử lý được phối trộn với nước theo tỷ lệ 1:2 (nguyên liệu:nước) và tiến hành siêu âm trong 15 phút để phá vỡ màng tế bào và diệt vi sinh vật tồn dư

3.7.3.2. Phản ứng tự thủy phân dưới tác dụng của hệ enzyme nội tại

Thiết bị phản ứng cần được trang bị áo nước (hoặc hơi) và cánh khuấy. Hỗn hợp nguyên liệu được nhào trộn trong thiết bị phản ứng. Sau khi nỗn hợp được khuấy đảo đồng đều tiến hành nâng nhiệt hỗn hợp lên mức 45±2 ⁰C. Cần giữ ổn định độ pH của hỗn hợp ở pH = 5,0 bằng cách cho thêm HCl 37%. Quá trình thủy phân được tiến hành ở nhiệt độ 45⁰C trong 6,0 giờ

3.7.3.3. Bất hoạt enzyme

Sau quá trình phản ứng, hỗn hợp được gia nhiệt trong thiết bị phản ứng lên nhiệt độ 95±2⁰C và giữ ở mức nhiệt độ này trong 15 phút.

Khi tháo sản phẩm phản ứng thủy phân sang thiết bị ly tâm vẫn thực hiện khuấy đảo để tránh lắng cặn.

3.7.3.4. Ly tâm tách bỏ cặn

Quá trình ly tâm được thực hiện trong máy ly tâm đứng Model Rotanta 460R. Thông số của quá trình ly tâm: vận tốc v=2000 vòng/phút, thời gian ly tâm 10 phút ở nhiệt độ t=30⁰C. Sau quá trình ly tâm, thu dịch đạm và loại bỏ bã.

3.7.3.5. Trung hòa dịch đạm

Quá trình được thực hiện trong thiết bị được chế tạo bằng vật liệu chịu kiềm và chịu acid có trang bị bộ phận khuấy đảo. Dịch đạm thủy phân được trung hòa bằng dung dịch NaOH 1M đến mức pH=7,2±0,2

Dung dịch trung hòa được mang đi lọc để loại bỏ tủa

3.7.3.6. Bảo quản dịch đạm

Dịch đạm được đóng trong chai có nắp đậy kín để tránh sự sâm nhập của vi sinh vật và bảo quản trong môi trường nhiệt độ 3÷5⁰C

3.8. Đánh giá chất lượng dịch đạm thu hồi từ thịt đỏ cá ngừ theo quy trình công nghệ đề xuất

3.8.1. Các chỉ tiêu lý-hóa của dịch thủy phân thịt đỏ cá ngừ.

Kết quả phân tích thành phần hóa học của dịch thủy phân được trình bày trong bảng 3.3.

Bảng 3.3. Kết quả phân tích thành phần hóa học dịch thủy phân

Chỉ tiêu phân tích	Đơn vị	Kết quả
Protein	%	3,05
Nước	%	90,4
Lipid	%	–
Muối	%	0.21

Kết quả phân tích thành phần hóa học của dịch đạm thủy phân cơ thịt đỏ cá ngừ thu được sau quá trình tự phân dưới tác dụng của enzyme cathepsine được xác định tại Nafiqad 2 (Đà Nẵng) cho thấy, hàm lượng protein trong mẫu dịch đạm thủy phân đạt 3,05%, so sánh với hàm lượng protein xác định được trong hỗn hợp nguyên liệu (24%) có thể ước tính hiệu suất thu hồi đạm của phản ứng tự phân là 30,12%. Ngoài ra, trong dịch đạm thủy phân còn chứa một lượng nhỏ là tro (1,53%) và hàm lượng nước ở mức 90,4%

Kết quả phân tích thành phần acid amin trong dịch thủy phân được trình bày trong bảng 3.4

Bảng 3.4. Kết quả phân tích thành phần acid amin của dịch thủy phân

STT	Acid amin	Kết quả (g/l)	STT	Acid amin	Kết quả (g/l)
1	Lysine	2,15	10	Methionine	1,30
2	Arginine	1,70	11	Leucine	1,89
3	Aspartic acid	2,05	12	Tryptophan	0,85
4	Glutamic acid	2,98	13	Valine	1,38
5	Tyrosine	1,05	14	Serine	1,01
6	Glycine	1,71	15	Phenylalanine	0,96
7	Threonine	0,99	16	Proline	1,15
8	Alanine	1,50	17	Isoleucine	1,22
9	Cystein	1,08	18	Histidine	0,64

Phân tích kết quả phân tích thành phần acid amin trong dịch thủy phân ở bảng 1, có thể thấy tổng lượng acid amin đạt 25,61 g/l. Dịch đạm thủy phân chứa các amin thiết yếu có giá trị cao về dinh dưỡng và sinh học như valine, leucine, isoleucine, methionine, threonine, phenylalanine, tryptophan, lysine, arginine, histidine.

Hình 3.11. Sắc kí đồ HPLC thu được khi phân tích thành phần acid amin của dịch đạm thủy phân thịt đỏ cá ngừ

Hàm lượng histamine là một trong những chỉ tiêu quan trọng để xác định chất lượng của dịch thủy phân thịt đỏ cá ngừ để sản xuất bột đạm dinh dưỡng từ nguyên liệu cá ngừ. Giới hạn hàm lượng histamine trong sản phẩm xác định bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC – High performance lipuid chromatography) được quy định tại quy chuẩn EC.2073/2005 không được vượt quá 200 ppm (mg/kg).

3.8.2. Các chỉ vi sinh của dịch thủy phân thịt đỏ cá ngừ.

Các chỉ phân tích vi sinh vật trong dịch thủy phân thịt đỏ cá ngừ được trình bày trong bảng 3.5

Bảng 3.5. Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh vật trong dịch thủy phân thịt đỏ cá ngừ

Chỉ tiêu phân tích	Đơn vị	Kết quả	Giới hạn cho phép theo TCVN
Tổng số vi sinh vật	CFU/ml	3,0 x 10²	≤ 10⁴
Coliform	CFU/ml	1	≤ 3
Escherichia coli	CFU/ml	1	≤ 3
Tổng số nấm men, mốc	CFU/ml	0,1 x 10²	≤ 10²
Staphylococcus aureus	CFU/ml	0,1 x 10²	≤ 10²
Salmonella spp	CFU/25ml	Âm tính	≤ 10²

Kết quả phân tích vi sinh vật cho thấy chất lượng của dịch thủy phân thịt đỏ cá ngừ cá ngừ phù hợp theo yêu của của tiêu chuẩn hiện hành. Cụ thể, các chỉ tiêu Coliforms, Escherichia coli, Staphylococcus aureus dưới mức 10 CFU/ml sản phẩm và tổng số vi sinh vật hiếu khí là 3,0 x 10¹ CFU/ml, các kết quả này đều nằm trong giới hạn cho phép. Điều này có thể giải thích do quá trình bảo quản bằng chất bảo quản có tác dụng tiêu diệt và ức chế quá trình phát triển của vi sinh vật trong sản phẩm.

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Từ kết quả nghiên cứu của luận văn, có thể rút ra một số kết luận như sau:

– Tỷ lệ thịt đỏ trong cá ngừ khai thác ở khu vực biển Đà Nẵng dao động trong khoảng từ 9,0 đến 12%, trong đó cá ngừ sọc dưa có tỷ lệ thịt đỏ cao nhất trong 3 mẫu phân tích, chiếm 12%, cá ngừ ồ có tỷ lệ thịt đỏ thấp nhất, chiếm 9,0%, còn lại cá ngừ mắt to có tỷ lệ thịt đỏ chiếm 10,5% trọng lượng cơ thể.

– Đã xác định được thành phần hóa học của hỗn hợp cơ thịt đỏ cá ngừ lấy mẫu từ nhà máy sản xuất đồ hộp Hạ Long như sau: hàm lượng protein là 24%, lipid 0,51%, nước 65%, tro 2%, thành phần khác chiếm 8,49%.

– Sử dụng chất bảo quản là kali sorbart có tác dụng rõ rệt và mạnh nhất trong sự ức chế vi sinh vật phát triển, tổng số lượng VSV luôn bị hạn chế dưới mức 2000 CFU/g trong suốt quá trình bảo quản để khảo sát.

– Quá trình tự thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ xảy ra chủ yếu dưới tác dụng của hệ enzyme cathepsin.

– Thông số phản ứng tự phân protein thịt đỏ cá ngừ dưới xúc tác của enzyme protease nội tại xác định được như sau: pH môi trường là 5,0, nhiệt độ phản ứng là 45⁰C, thời gian phản ứng là 6 giờ, tỷ lệ phối trộn nguyên liệu: nước là 1:2. Khi đó hiệu suất thu dịch đạm đạt 61,46%.

LIỆN HỆ:

SĐT+ZALO: 0935568275

E:\DỮ LIỆU COP CỦA CHỊ YẾN\DAI HOC DA NANG\CONG NGHE SINH HỌC\CONG NGHE SINH HOC\TRAN TRUNG THANH BINH