Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và kháng viêm của cao chiết lá cây thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban)

1. Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam là nước nhiệt đới ẩm nên bệnh liên quan đến viêm đường hô hấp, viêm phổi chiếm tỷ lệ khá cao. Việc điều trị chủ yếu sử dụng kháng sinh hoặc dùng thuốc hen như theophylin, ephedrin, corticosteroid. Tuy nhiên các loại thuốc này gây ra rất nhiều tác dụng phụ không mong muốn và dùng lâu dài sẽ gây hiện tượng quen thuốc.

Thực vật được xem như là một trong những nguồn dược liệu thay thế lý tưởng vì mức độ an toàn, không hoặc ít phản ứng phụ và có nhiều đích tác động khác nhau lên tế bào vi khuẩn nên ít có nguy cơ gây ra sự kháng thuốc.

Thuốc thượng còn có tên Thuốc mọi, Da xà lắc, Thuốc dấu cà doong, tên khoa học là Phaeanthus vietnamensis Ban, thuộc họ Na – Annonaceae. Lá dùng làm thuốc có tác dụng chống viêm (chữa đau mắt, mụn nhọt, chữa tiêu chảy ở người và gia súc); vỏ rễ và vỏ thân cùng với lá nấu cao dán chỗ mụn nhọt sưng tấy.

Xuất phát từ mong muốn bảo tồn, phát triển và ứng dụng tiềm năng của các cây thuốc dân gian, đồng thời cung cấp các dữ liệu khoa học về khả năng điều trị bệnh và tìm kiếm liệu pháp chữa trị bệnh an toàn từ thiên nhiên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và kháng viêm của cao chiết lá cây thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban)”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

2.1. Mục tiêu tổng quát

Đánh giá được khả năng kháng khuẩn, kháng viêm của cao chiết lá cây thuốc Thượng.

2.2. Mục tiêu cụ thể

– Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của cao chiết từ lá cây thuốc Thượng trên một số chủng vi khuẩn gây viêm đường hô hấp trên người.

– Đánh giá tác động điều trị của cao chiết trên mô hình chuột nhắt trắng gây bệnh viêm phổi.

3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

3.1. Ý nghĩa khoa học

– Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp những bằng chứng khoa học mới về tính kháng khuẩn, kháng viêm của cao chiết từ lá cây thuốc Thượng;

– Là nguồn tài liệu tham khảo cho công tác nghiên cứu tiếp theo để bổ sung nguồn nguyên liệu dược liệu trong hỗ trợ và điều trị kháng khuẩn, kháng viêm.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

– Kết quả nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm là cơ sở lý thuyết để có thể tham khảo nghiên cứu các sản phẩm Đông dược điều trị viêm đường hô hấp.

4. Bố cục đề tài

Gồm 3 phần:

– Phần mở đầu

– Phần nội dung

+ Chương 1. Tổng quan tài liệu

+ Chương 2. Đối tượng, nội dung, phạm vi và phương pháp nghiên cứu

+ Chương 3. Kết quả và bàn luận

– Phần kết luận và kiến nghị

– Danh mục tài liệu tham khảo

– Phụ lục

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan vấn đề nghiên cứu

1.1. Tổng quan về loài Phaenthus Vietnamensis

1.1.1. Đặc điểm, phân loại

Tên khoa học: Phaenthus Vietnamensis Ban

Tên tiếng Việt: Cây thuốc Thượng; thuốc mọi; thuốc dấu cà doong; da xà lắc.

Cây thuốc Thượng được phân loại như sau:

Nhánh: Basal Angiosperms

Nhánh: Magnoliids – Ngọc Lan

Bộ: Magnolialex – Ngọc Lan

Họ: Annonaceae – Na

Phân họ: Malmeoideae

Tông: Miliusese

Chi: Phaeanthus Hook.f. &Thomson

Loài: Phaenthus Vietnamensis Ban

Thuốc Thượng là cây gỗ nhỏ hoặc cây bụi, cao chừng 2-10m. Cành non, gần như không lông. Lá thuôn hoặc gần hình mác. Hoa mọc so le với lá. Lá noãn nhiều; núm nhụy hình đầu, không có vòi nhụy. Noãn 1, bao phấn đính gốc. Vỏ quả rất mỏng.

1.1.2. Phân bố

Trung Bộ Việt Nam: Thừa Thiên – Huế (Phú Lộc), Quảng Nam (Đại Lộc, Quế Sơn, Núi Thành, Duy Xuyên, Tiên Phước, Phước Sơn, Đông Giang.

1.1.3. Đặc điểm sinh học, sinh thái

Cây ra hoa từ tháng 5 đến tháng 12, có quả tháng 6 đến tháng 1 năm sau. Mọc rải rác dưới tán rừng thưa, rừng thứ sinh nơi ẩm, ở độ cao dưới 300m.

1.1.4. Công dụng

Bộ phận dùng là lá, vỏ thân, vỏ rễ. Thuốc Thượng có vị đắng; có tác dụng hoạt huyết, giảm đau, tiêu viêm, kháng khuẩn, sát trùng, có thể hạ đường huyết; chủ trị viêm loét dạ dày, nhiễm trùng đường ruột, co thắt đại tràng, hen phế quản.

1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Phaenthus

1.2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Phaeanthus được bắt đầu từ năm 1968.

Năm 1983, T. A. Van-Beek đã phân lập được hợp chất phaeanthine và phaeantharine từ lá và vỏ cây loài Phaeanthus ebracteolatus. Năm 1990, từ loài Phaeanthus crassipetalus Fasihuddin và cộng sự cũng phân lập được hai hợp chất phaeathine và limacine. Đến năm 2007, Khalijah Awang cùng các cộng sự đã chiết tách được 2 alkaloid seco-benzylisoquinoline mới là pecrassipine A và pecrassipine B cùng với 7 alkaloid đã biết. Tiếp đến năm 2011, Pei Jean Tan và các cộng sự đã xác định được cấu trúc của một hợp chất mới là 7-formyl-151-hydroxypurpurin-7-lactone methyl ester và phân lập được năm hợp chất.

Tuy nhiên, các nghiên cứu về hoạt tính sinh học các loài thuộc chi Phaeanthus còn khá ít. Năm 2013, Hairin Taha và các cộng sự nghiên cứu tác dụng chống lại sự co thắt gây ra bởi NE của loài Phaeanthus crassipetalus. Năm 2017, Nguyen Xuan Nhiem và cộng sự đã công bố tác dụng ức chế hoạt động của sản phẩm gây viêm oxit nitrit (NO) của 3 hoạt chất mới phân lập gồm từ cây Phaeanthus vietnamensis Ban.

1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

Cây thuốc Thượng là một loài cây thuốc quý được sử dụng trong dân gian để giảm đau, tiêu viêm, kháng khuẩn, hạ đường huyết; đặc biệt chủ trị viêm loét dạ dày, nhiễm trùng đường ruột,…

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học từ các chiết xuất các loài thuộc chi Phaeanthus còn rất hạn chế. Năm 1991, Nguyễn Thị Nghĩa và các cộng sự đã phân lập được tám alkaloid từ lá của loài Phaeanthus vietnamensis. Năm 2012, Võ Duy Lê Sơn Đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh đã nghiên cứu Định tính- định lượng – chiết tách và khảo sát hoạt chất kháng khuẩn của hợp chất Alkaloid trong cây thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban).

Năm 2014, Đào Hùng Cường và cộng sự đã nghiên cứu về thành phần hóa học từ cây thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban). Tuy nhiên đây mới chỉ là bước đầu mang tính chất thăm dò, cần có nhiều hơn nữa các nghiên cứu về thành phần hoạt chất cũng như các hoạt tính sinh học chuyên sâu của loài cây thuốc đặc hữu Việt Nam Phaeanthus vietnamensis Ban.

1.3. Cấu trúc của phổi và cơ chế viêm đường hô hấp

1.3.1. Cấu trúc của phổi

Phổi là một cơ quan của hệ hô hấp, nằm bên trong lồng ngực có đặc tính đàn hồi, mềm và xốp, là cơ quan quan trọng trong cơ thể với chức năng chủ yếu là trao đổi không khí giữa môi trường và cơ thể con người.

1.3.2. Cơ chế viêm – dị ứng đường hô hấp

1.3.3. Vai trò của một số cytokine trong phản ứng viêm – dị ứng

Cytokine là những protein hay glycoprotein được tạo ra bởi nhiều loại tế bào khác nhau. Chúng đóng vai trò đặc trưng trong sự tác động qua lại và truyền thông tin giữa các tế bào. Một cytokin thường ảnh hưởng đến sự tổng hợp các cytokin khác. Chúng có thể tăng cường hay ức chế sản xuất cytokin khác. Chúng được sản xuất khi cần thiết trong phản ứng miễn dịch.

Dưới đây là một số cytokines liên quan đến phản ứng viêm – dị ứng đường hô hấp được đề cập trong nghiên cứu này.

Interleukin 4 (IL-4)

Interleukin 5 (IL-5)

Interleukin 13 (IL-13)

Interleukin 12 (IL-12)

Interferon – gamma (IFN-γ)

GATA 3

1.4. Tổng quan về một số loại vi khuẩn, kháng sinh và tình hình kháng kháng sinh ở vi khuẩn gây bệnh trên người

1.4.1. Tổng quan về một số loại vi khuẩn

a. Pseudomonas aeruginosa

b. Staphylococcus aureus

c. Escherichia coli

1.4.2. Kháng sinh và kháng sinh thực vật

a. Kháng sinh

b. Phân loại kháng sinh

c. Kháng sinh thực vật

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

– Nguyên liệu thực vật

Đối tượng nghiên cứu là cây thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban). Lá cây thuốc Thượng dùng trong nghiên cứu được cung cấp bởi bệnh viện Y học Cổ truyền thành phố Đà Nẵng, địa điểm thu hái tại huyện Quế Sơn, tỉnh Quảng Nam.

– Chủng vi khuẩn

3 chủng vi khuẩn dùng để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết thuốc Thượng, bao gồm 2 chủng vi khuẩn Gram âm: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli và 1 chủng vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus. Các chủng vi khuẩn được cung cấp bởi Khoa Vi sinh lâm sàng – Bệnh viện C Đà Nẵng.

– Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng đực (6 tuần tuổi) được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế – IVAC được nuôi trong cùng điều kiện, cùng chế độ dinh dưỡng trong suốt quá trình nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học và Giải phẫu sinh lý người và động vật, khoa Sinh – Môi trường, Đại học Sư phạm Đà Nẵng.

2.2. Nội dung nghiên cứu

– Nội dung 1: Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của cao chiết lá thuốc Thượng trên 3 chủng vi khuẩn gây bệnh người bao gồm Escherichia Coli, Staphylococus aureus, Pseudomonas aeruginosa.

– Nội dung 2: Nghiên cứu tác dụng kháng viêm của cao lá thuốc Thượng trên mô hình chuột nhắt trắng gây viêm phổi- dị ứng.

2.3. Phạm vi nghiên cứu

– Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học và phòng thí nghiệm Giải phẫu sinh lý người và động vật, khoa Sinh – Môi trường, Đại học Sư phạm Đà Nẵng.

– Về khả năng kháng viêm của cao chiết lá cây thuốc Thượng, thí nghiệm nghiên cứu trên mô hình chuột nhắt trắng viêm phổi gây bởi OVA.

– Về khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá cây thuốc Thượng, thí nghiệm nghiên cứu trên 3 chủng vi khuẩn gây bệnh trên người là Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli.

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp điều chế cao chiết từ nguyên liệu thực vật

2.4.2. Phương pháp xác định một số hợp chất từ cao chiết

2.4.3. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn và xác định hoạt tính kháng khuẩn

2.4.4. Phương pháp thử nghiệm cao chiết trên mô hình chuột viêm-dị ứng phổi

a. Thiết lập mô hình hen suyễn và điều trị

Sơ đồ 2.2. Mô hình hen suyễn và điều trị

b. Thu dịch phổi (BALF) và đếm các loại tế bào

c. Nhuộm và quan sát mô phổi

d. Đo kháng thể đặc hiệu OVA và sản phẩm tiết của các tế bào T biệt hóa trong dịch phổi

2.2.5. Xử lý số liệu

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Xác định thành phần hóa học của cao chiết thuốc Thượng

Thành phần hóa học trong chiết xuất cao lá thuốc Thượng được xác định bởi khảo sát GC-MS. Có 22 hợp chất có thời gian lưu khác nhau được phát hiện trong cao chiết đun hồi lưu.

Trong 22 hợp chất, có đến 16 hợp chất đã được báo cáo có tính kháng viêm, bao gồm Germacrene D, Bicyclogermacrene, Spathulenol, Isospathulenol, Neophytadiene, n-Hexadecanoic acid, Eicosane, 9,12-Octadecadienoic acid (z,z)-, methyl ester; N-methylcorydaldine, Oleic acid, Linoleic acid ethyl ester, Octadecanoic acid ethyl ester, Campesterol, Stigmasterol, Gamma – Sitosterol, Bis (-2-ethylhexyl) phthalate.

Có 9 hợp chất được báo cáo có hoạt tính kháng khuẩn gồm Germacrene D; Bicyclogermacrene; Neophytadiene; n-Hexadecanoic acid; Hexadecanoic acid ethyl ester; Eicosane; 9,12-Octadecadienoic acid (z,z)-, methyl ester; Stigmasterol; Gamma – Sitosterol.

Có 9 hợp chất được báo cáo có hoạt tính chống oxy hóa bao gồm Germacrene D, Bicyclogermacrene, Neophytadiene, n-Hexadecanoic acid, Hexadecanoic acid, Oleic acid, Vitamin E, Octadecanoic acid ethyl ester, Campesterol.

3 hợp chất có hoạt tính chưa được báo cáo gồm có 1,1,4,7-Tetramethyldecahydro-1H-cyclopropa[e]azulene-4, 7-diol; Methyl stearate; 1,2,3,4-Tetrahydroisoquinolin-6-ol-1-carboxylic acid,7-methoxy-1-methyl-, methyl ester.

Như vậy, qua việc đánh giá sơ bộ thành phần hợp chất trong cao chiết ethanol lá cây thuốc Thượng bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ, chúng tôi ghi nhận được 22 hợp chất, trong đó có đến 16 hoạt chất được báo cáo có tính kháng viêm mạnh, 9 hoạt chất kháng khuẩn và 9 hoạt chất chống oxy hóa, bởi vậy chúng tôi đã sử dụng cao chiết tổng để thử nghiệm tác dụng kháng viêm của thuốc Thượng trên mô hình chuột gây viêm phổi bởi OVA và thử nghiệm tác dụng kháng khuẩn trên 3 loại vi khuẩn gram âm và gram dương khác nhau.

3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết thuốc Thượng

3.2.1. Tác dụng của cao chiết thuốc Thượng lên Pseudomonas aeruginosa

Bảng 3.2. Khả năng kháng Pseudomonas aeruginosa của cao chiết thuốc Thượng

Trong thí nghiệm này, mẫu P. aeruginosa chỉ kháng 5 loại kháng sinh bao gồm Ac, Cu, Cx, Im, Ct và nhạy với các loại kháng sinh còn lại.

Để đánh giá mức độ tác động của cao chiết thuốc Thượng lên P. aeruginosa so với các loại kháng sinh, thí nghiệm sử dụng 2 loại kháng sinh nhạy Meropenem (Me) và kháng sinh bị kháng Amoxicillin (Ac) làm đối chứng.

Kết quả cho thấy, cao chiết có khả năng ức chế vi khuẩn P. aeruginosa ở các nồng độ khảo sát từ 100 mg/ml đến 800 mg/ml. Và khả năng kháng tăng dần theo chiều tăng của nồng độ cao chiết, vòng vô khuẩn đạt giá trị cao nhất tại nồng độ 800 mg/ml với đường kính đạt 13,25 mm, Trong khi đó, đường kính vòng vô khuẩn của kháng sinh đối chứng Amoxillin là 0 mm và Meropenem đạt 27,75 mm. Kết quả này cho thấy tác dụng kháng P. aeruginosa của cao chiết thuốc Thượng khá yếu và thấp hơn so với tác dụng kháng khuẩn của kháng sinh Meropenem.

Hình 3.2. Khả năng kháng Pseudomonas aeruginosa của cao chiết thuốc Thượng

(A) Kháng sinh đồ của P. aeruginosa. (B) Cao chiết thuốc Thượng ức chế P. aeruginosa ở các nồng độ pha loãng khác nhau. (1) Cao chiết 800 mg/ml, (2) Cao chiết 600 mg/ml, (3) Cao chiết 400 mg/ml, (4) Cao chiết 200 mg/ml, (5) Cao chiết 100 mg/ml, (6) DMSO 5%, (7a) Kháng sinh Meropenem (Me), (7b) Kháng sinh Amoxicillin (Ac).

3.2.2. Tác dụng của cao chiết thuốc Thượng lên Staphylococcus aureus

Bảng 3.3. Khả năng kháng Staphylococcus aureus của cao chiết thuốc Thượng

Để đánh giá mức độ tác động của cao chiết thuốc Thượng lên S. aureus so với các loại kháng sinh, thí nghiệm sử dụng kháng sinh Ciprofloxacin (Ci) và Vancomycin (Va) làm đối chứng.

Khả năng kháng vi khuẩn S. aureus của cao chiết thuốc Thượng được minh họa qua bảng 3.3 và hình 3.3 B. Kết quả cho thấy, cao chiết có khả năng ức chế vi khuẩn S. aureus ở các nồng độ khảo sát từ 100 mg/ml đến 800 mg/ml. Và khả năng kháng gần như không thay đổi theo chiều tăng của nồng độ cao chiết. Tại nồng độ cao 800 mg/ml, đường kính vòng vô khuẩn đạt giá trị đạt 17,25 mm, và ở nồng độ cao chiết thấp nhất 100 mg/ml, đường kính vòng vô khuẩn đạt giá trị đạt 16,25 mm. Trong khi đó, đường kính vòng vô khuẩn của kháng sinh đối chứng Ciprofloxacin là 0 mm và Vancomycin đạt 8,5 mm, giá trị chỉ bằng một nửa so với đường kính vòng vô khuẩn của cao chiết. Kết quả này cho thấy tác dụng kháng S. aureus của cao chiết thuốc Thượng cao hơn so với tác dụng kháng khuẩn của các loại kháng sinh sử dụng trong thí nghiệm này.

Hình 3.3. Khả năng kháng Staphylococcus aureus của cao chiết thuốc Thượng

(A) Kháng sinh đồ của S. aureus . (B) Cao chiết thuốc Thượng ức chế S. aureus ở các nồng độ pha loãng khác nhau. (1) Cao chiết 800 mg/ml, (2) Cao chiết 600 mg/ml, (3) Cao chiết 400 mg/ml, (4) Cao chiết 200 mg/ml, (5) Cao chiết 100 mg/ml, (6) DMSO 5%, (7a) Kháng sinh Ciprofloxacin, (7b) Kháng sinh Vancomycin.

3.2.3. Tác dụng của cao chiết thuốc Thượng lên Escherichia coli

Bảng 3.4. Khả năng kháng Escherichia coli của cao chiết thuốc Thượng

Trong thí nghiệm này, E. coli kháng mạnh trên 2 loại và kháng yếu trên 3 loại kháng sinh sử dụng. Thí nghiệm sử dụng kháng sinh Meropenem (Me) và Ciprofloxacin (Ci) làm đối chứng.

Kết quả cho thấy, cao chiết không có khả năng ức chế vi khuẩn E. coli ở các nồng độ khảo sát tăng dần từ 100 mg/ml đến 800 mg/ml. Ở các nồng độ cao chiết khác nhau đường kính vòng vô khuẩn dao động từ 0 – 4,75 mm. Đường kính vòng vô khuẩn của kháng sinh đối chứng Ciprofloxacin là 0 mm và Meropenem đạt 20,5 mm.

Hình 3.4. Khả năng kháng Escherichia coli của cao chiết thuốc Thượng.

(A) Kháng sinh đồ của E. coli . (B) Cao chiết thuốc Thượng ức chế E. coli ở các nồng độ pha loãng khác nhau. (1) Cao chiết 800 mg/ml, (2) Cao chiết 600 mg/ml, (3) Cao chiết 400 mg/ml, (4) Cao chiết 200 mg/ml, (5) Cao chiết 100 mg/ml, (6) DMSO 5%, (7a) Kháng sinh Meropenem (Me), (7b) Kháng sinh Ciprofloxacin (Ci).

Bảng 3.5. Giá trị MIC và MBC của cao chiết thuốc Thượng trên

3 loại vi khuẩn khác nhau

Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của cao chiết thuốc Thượng đối với P. aeruginosa và S. aureus là như nhau, lần lượt ở các nồng độ 125 và 250 mg/ml. E. coli không xác định được cả MIC và MBC trong khuôn khổ thí nghiệm này.

Tóm lại, trong 3 loại vi khuẩn trên, cao chiết ethanol lá cây thuốc Thượng chỉ có hiệu quả ức chế trên 2 loại vi khuẩn là trực khuẩn mủ xanh Pseudomonas aeruginosa và đặc biệt là tụ cầu vàng kháng nhiều loại kháng sinh Staphylococcus aureus. Theo nghiên cứu từ tác giả Trần Công Luận và cộng sự (2015), cao chiết toàn phần từ cành và lá cây thuốc Thượng cũng có khả năng kháng mạnh trên chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa và 2 chủng Staphylococcus aureus kháng kháng sinh ATCC 43300 (MRSA), ATCC 25953 (MSSA). Kết quả kháng khuẩn từ cao chiết toàn phần của cành và lá cây thuốc Thượng của nhóm tác giả trên cũng tương thích với kết quả kháng khuẩn từ cao chiết lá cây thuốc Thượng trong nghiên cứu này

3.3. Tác dụng kháng viêm của cao chiết thuốc Thượng

3.3.1. Tác động của PVE đến sự tích lũy các tế bào viêm trong phổi

Hình 3.5. PVE ức chế sự tích lũy của các tế bào viêm và tổng tế bào trong dịch phổi

(A) Các giá trị được biểu hiện có ý nghĩa ± SD (6 chuột/nhóm). (B) Dịch phổi được thu 24 giờ sau lần thử thách cuối cùng, tế bào được phân lập trên slide bởi quay ly tâm và nhuộm với thuốc nhuộm Diff-Quick.

Số lượng của các tế bào viêm eosinophil, neutrophil, macrophage và tổng tế bào trong dịch phổi được ghi nhận có sự gia tăng rất mạnh ở nhóm chuột OVA khi so với nhóm chuột bình thường Naive (P < 0.001). Ngược lại, ở nhóm chuột điều trị PVE 100 và 200 mg/kg cho thấy đã ức chế được sự xâm nhập của các tế bào eosinophil, cũng như tổng tế bào vào trong phế nang (P < 0.01, P < 0.001). Neutrophil và macrophage cũng có xu hướng giảm sau điều trị nhưng không có ý nghĩa về mặt thống kê (hình 3.5 A).

Nhuộm Diff-Quick đã cho thấy nhóm OVA có sự xâm nhập quá mức các tế bào viêm trong dịch phổi, vòng tròn đỏ đánh dấu sự hiện diện của các tế bào eosinophil, vòng tròn vàng đánh dấu sự có mặt của tế bào neutrophil, vòng tròn trắng đánh dấu sự xâm nhập của tế bào macrophage (hình 3.5 B). Ngược lại, quan sát nhóm PVE 100 và PVE 200 nhận thấy đã giảm hẳn sự hiện diện của tế bào viêm eosinophil và neutrophil trong dịch phổi (hình 3.5 B).

3.3.2. Tác động của PVE lên tình trạng viêm và sự thay đổi cấu trúc mô phổi

Mô phổi sau khi xử lý được nhuộm lần lượt bằng các thuốc nhuộm Hematoxylin & Eosin (H&E), Periodic Acid-Schiff (PAS), Masson Trichrome. Trong nhóm chuột OVA, phế quản và khu vực phế nang có sự thay đổi rõ rệt về mô bệnh học so với nhóm chuột bình thường Naive. Ở hình 3.6 A, có thể dễ dàng nhận thấy nhóm chuột OVA lớp biểu mô phế quản bị phù nề và lớp cơ trơn trở nên dày hơn các nhóm còn lại (mũi tên đen 2 đầu chỉ độ dày của thành phế quản). Đồng thời ở quanh ống phế quản và khu vực phế nang có sự hiện diện mật độ dày đặc của các tế bào viêm (mũi tên xanh chỉ khu vực dày đặc các leukocytes).

Ở nhóm chuột được điều trị PVE các liều khác nhau, ta có thể nhận thấy có sự giảm dần các triệu chứng viêm như trên. Nhóm PVE 100 và PVE 200 có sự cải thiện tình trạng viêm đáng kể, thành phế quản không bị phù nề, lớp biểu mô và cơ trơn mỏng, và khu vực phế nang không bị xâm nhập bởi các tế bào viêm (hình 3.6 A).

Nhuộm PAS cho thấy nhóm OVA gia tăng sự hiện diện của tế bào goblet cùng với dịch nhầy do các tế bào đó tiết ra ở mặt trong đường phế quản (phần màu tím đậm được xác định bởi mũi tên đen). Dịch nhầy vẫn xuất hiện ở nhóm chuột điều trị PVE 50, nhưng có cải thiện rõ rệt ở nhóm điều trị PVE 100 và PVE 200. (hình 3.6 B).

Nhuộm Masson Trichrome để xác định sự xơ hóa hay collagen hóa của phần cơ trơn quanh phế quản và mạch máu. Nhóm OVA có sự xơ hóa xung quanh ống phế quản, mạch máu và phế nang, phần xơ hóa xen cả vào lớp biểu mô của thành phế quản (mũi tên vàng). Sau khi được điều trị bởi PVE ở các liều độc lập, 2 nhóm chuột PVE 100 và PVE 200 được cải thiện tình trạng xơ hóa (hình 3.6 C).

Tóm lại, việc quan sát kính hiển vi mô phổi đã cho thấy PVE có tác dụng bảo vệ cấu trúc phế quản và phế nang, giảm được sự xâm nhập của các tế bào viêm vào khu vực phế nang, sưng phù đường phế quản và xơ hóa khu vực xung quanh phế quản, mạch máu và phế nang.

Hình 3.6. PVE ngăn chặn sự thay đổi cấu trúc mô phổi trong mô hình chuột viêm – dị ứng phổi gây bởi OVA

(A) Mô được nhuộm bởi H&E. (B) Mô được nhuộm bởi PAS. (C) Mô được nhuộm bởi Masson Trichrome.

3.3.3. Tác động của PVE lên việc điều hòa mức độ các kháng thể đặc hiệu OVA trong serum

Lượng kháng thể liên quan đến tế bào Th2 như là OVA specific IgE và IgG1, và kháng thể liên quan tế bào Th1 như OVA specific IgG2a.

Mức độ của anti-OVA specific IgE và anti-OVA specific IgG1 được ghi nhận gia tăng mạnh một cách có ý nghĩa (P<0.001) ở nhóm chuột OVA khi so sánh với nhóm chuột Naive. Tuy nhiên, sau khi chuột được điều trị bằng PVE với các nồng độ tăng dần thì mức độ hai loại kháng thể đặc hiệu OVA này cũng giảm đi đáng kể trong serum khi so sánh với nhóm chuột OVA (Hình 3.7).

Bên cạnh đó, lượng kháng thể đặc hiệu OVA IgG2a lại không có sự khác biệt ở nhóm OVA so với nhóm Naive, nhưng lại gia tăng (P<0.05) ở các nhóm điều trị PVE nồng độ 50 và 100 mg/kg trọng lượng cơ thể (Hình 3.7).

Điều này chứng tỏ rằng việc điều trị PVE có tác dụng hạn chế phản ứng viêm dị ứng thông qua việc ức chế tác nhân đầu mối của phản ứng miễn dịch type I là IgE và IgG1, đồng thời thúc đẩy hình thành tác nhân hạn chế phản ứng viêm là IgG2a

Các chất tiết tế bào Th2 được ghi nhận là có vai trò quan trọng trong phản ứng dị ứng thông qua việc điều hòa các kháng thể OVA specific IgE và OVA specific. IgG1. Như đã nói ở trên, chuột sau khi được điều trị với PVE ở các nồng độ đã có sự điều chỉnh giảm của các chất tiết tế bào Th2, điều này cũng tương thích với sự ổn định về liều lượng của hai kháng thể đặc hiệu IgE và IgG1 trong serum.

Hình 3.6. Tác động của PVE lên mức độ (A) ovalbumin (OVA)-specific IgE, (B) OVA-specific IgG1 và (C) OVA-specific IgG2 trong serum của chuột viêm phổi gây bởi OVA.

3.3.4. Tác động của PVE lên sự điều hòa cân bằng các phản ứng tế bào helper T trong dịch phổi

Hình 3.7. Tác động của PVE đến sự cân bằng các chất tiết tế bào

Th1/Th2 trong dịch phổi.

Sự cân bằng của các sản phẩm tiết liên quan tế bào helper T được đánh giá để xem xét tác động của PVE lên mô hình chuột viêm phổi gây bởi OVA. Các cytokines liên quan đến tế bào Th2 bao gồm IL-4, IL-5, IL-13, GATA 3 và cytokines liên quan Th1 gồm có IL-12, IFN-γ được biết đến có chức năng điều hòa phản ứng viêm – dị ứng liên quan IgE [29], [32]. Lượng IL-4, IL-5, IL-13 và GATA 3 trong dịch phổi ở nhóm chuột OVA tăng mạnh (P < 0.01, P< 0.001) khi so với nhóm chuột bình thường Naive. Còn lượng IL-12 thì giảm (P < 0.05) so với chuột bình thường. IFN-γ không có sự sai khác giữa nhóm OVA và Naive.

Tuy nhiên, sau khi uống đường miệng PVE ở các liều lượng khác nhau, ở liều 100 và 200 mg/kg trọng lượng cơ thể cho thấy có sự ức chế gia tăng các chất tiết tế bào liên quan Th2 bao gồm IL-4, IL-5, IL-13 và cả GATA 3 khi so với nhóm chuột OVA. Đồng thời, nhóm chuột được điều trị cũng thúc đẩy tăng lượng IL-12 trong dịch phổi, IFN-γ không thấy có sự sai khác nào so với nhóm OVA.

Kết quả trên chỉ ra rằng PVE đã có tác dụng điều hòa phản ứng miễn dịch thông qua việc kiểm soát sự cân bằng giữa các chất tiết tế bào Th1/Th2 trên mô hình chuột viêm phổi gây bởi OVA.

Tóm lại, cao chiết ethanol lá cây thuốc Thượng đã có tác động tích cực lên bệnh lý viêm phổi – dị ứng trong mô hình chuột gây bệnh bởi OVA. Cao chiết đã làm giảm các tế bào viêm như eosinophil, macrophage và tế bào goblet xâm nhập vào trong phổi. Qua đó đã cải thiện sự thay đổi cấu trúc phổi như giảm phù nề thành phế quản, giảm gia tăng tiết dịch nhầy, hạn chế sự xơ hóa quanh ống phế quản và mạch máu. Đồng thời, cao chiết thuốc Thượng đã điều hòa cân bằng các cytokines liên quan đến tế bào Th1/Th2 trong dịch phổi, cũng như các kháng thể đặc hiệu OVA trong máu, qua đó ức chế các phản ứng miễn dịch xảy ra quá mức.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Từ những kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi rút ra các kết luận sau:

– Cao chiết ethanol lá cây thuốc Thượng có khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng kháng sinh rất mạnh hiện nay.

– Cao chiết ethanol lá cây thuốc Thượng có khả năng ức chế yếu lên sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa.

– Cao chiết ethanol lá cây thuốc Thượng có tiềm năng trong việc điều trị bệnh viêm phổi – dị ứng thông qua việc điều hòa sự cân bằng của các cytokines liên quan tế bào T helper 1 và T helper 2 trong hệ thống miễn dịch.

KIẾN NGHỊ

– Tiếp tục khảo sát thêm các hợp chất trong cao chiết lá cây thuốc Thượng.

– Phân lập các hợp chất chính kháng viêm và kháng khuẩn trong cao chiết lá cây thuốc Thượng để thử hoạt tính kháng viêm và kháng khuẩn nhằm mang lại hiệu quả điều trị cao hơn.

LIỆN HỆ:

SĐT+ZALO: 0935568275

E:\DỮ LIỆU COP CỦA CHỊ YẾN\DAI HOC DA NANG\SINH HOC\NGUYEN THI DONG HANG