NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYM LIPASE TỪ MỦ ĐU ĐỦ VÀ ỨNG DỤNG VÀO QUÁ TRÌNH LÀM GIÀU DHA, EPA TRONG DẦU CÁ HỒI
Năm 1848, một trong số những loại enzym vô cùng quan trọng lần đầu tiên được khám phá bởi nhà sinh lý học người Pháp Claude Bernard, đó là enzym lipase [1]. Trên thực tế, từ trước mốc thời gian này, nhân loại đã biết đến một số cách ứng dụng lipase thông qua việc sử dụng dịch chiết từ tuyến tụy của một số loại động vật. Kể từ đó, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã bắt đầu quá trình tìm hiểu và nghiên cứu về loại enzym này, mở ra một kỉ nguyên mới với sự ứng dụng rộng rãi và toàn diện của enzym lipase như ngày nay.
Lipase (triacylglycerol acylhydrolases EC 3.1.1.3) là enzym thuộc lớp các enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân (hydrolase) chất béo (triglycerides) thành glycerol và các axit béo tự do. Lipase có hoạt tính xúc tác chọn lọc rất cao, nhờ đặc tính này mà lipase ngày càng được ứng dụng phổ biến trong nhiều lĩnh vực: thực phẩm, hóa chất tẩy rửa, mỹ phẩm, tổng hợp các chất hữu cơ, dược phẩm,… [2].
Lipase được tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau: thực vật, động vật, côn trùng hoặc các vi sinh vật. Ở động vật, lipase được tìm thấy ở tụy và niêm mạc dạ dày. Ở côn trùng, lipase được tìm thấy trong huyết thanh và nước bọt. Ở thực vật, lipase hiện diện phần lớn trong các mô của thực vật hạt kín [3]. Phần lớn lipase hiện nay được nghiên cứu và ứng dụng chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật [2].
Lipase từ thực vật tuy chỉ chiếm một phần nhỏ trong nền công nghiệp sản xuất enzym nhưng với nhiều ưu điểm như giá thành thấp, là enzym cố định tự nhiên, dễ dàng chấp nhận và được sử dụng trực tiếp như chất xúc tác sinh học ở dạng chế phẩm thô nên gần đây loại enzym này đã được quan tâm và nghiên cứu khá phổ biến [4].
Đu đủ thường được biết đến với enzym papain – một loại protease đã được thương mại hóa từ lâu và có nhiều ứng dụng trên thực tế. Tuy vậy, lipase từ đu đủ hiện nay cũng đã được nghiên cứu ở nhiều nơi trên thế giới và được sử dụng khá phổ biến trong các ngành công nghiệp thực phẩm, công nghiệp tẩy rửa, hóa học và y học. Trong khi đó, cây đu đủ được trồng phổ biến ở nhiều vùng của nước ta nhưng chủ yếu chỉ để thu nhận papain từ phần protein có khả năng tan trong nước, rất nhiều các enzym khác có trong mủ đu đủ, mà tiêu biểu là lipase vẫn chưa được tận dụng triệt để [5].
Trong thời gian gần đây, một trong những ứng dụng quan trọng và nổi trội của enzym lipase với ngành công nghệ thực phẩm là biến đổi cấu trúc chất béo theo hướng mong muốn hoặc làm giàu, tách chiết các axit béo thiết yếu – axit béo không no đa nối đôi.
Khoa học hiện đại đã chứng minh các axit béo không no chứa nhiều nối đôi (PUFAs) đóng một vai trò hết sức quan trọng đối với sức khỏe con người. Dầu cá từ lâu lại được biết đến như một nguồn không thể thiếu cung cấp các axit béo không no chứa nhiều nối đôi (PUFA). Trong các loại dầu cá biển như cá hồi, cá thu, cá mòi, cá ngừ…. thường có chứa một lượng n-3PUFA lớn, trong đó có hai loại đặc biệt được quan tâm là DHA (acid docosahexaenoic) và EPA (acid eicosapentaenoic). Các nghiên cứu gần đây đã khẳng định rằng hai loại axit béo này có vai trò điều hòa ổn định mức độ cholesterol và LDL (Low Density Lipoprotein) trong máu. Vì vậy, việc bổ sung các axít béo trên một cách thích hợp giúp duy trì mức độ bình thường của cholesterol trong cơ thể, góp phần ngăn ngừa các bệnh về tim mạch cũng như nguy cơ gây xơ vữa động mạch. Ngoài ra, những axit béo không no này cũng là thành phần không thể thiếu trong khẩu phần ăn của trẻ em bởi chúng có khả năng tăng cường thị giác và sự phát triển của trí não [6].
Trong số các loại cá được con người sử dụng làm thực phẩm, cá hồi (Salmon salar) đã được biết đến là một trong những thực phẩm giàu chất dinh dưỡng nhất. Đặc biệt, trong dầu cá hồi có chứa hàm lượng lớn các loại axit béo chưa bão hòa, tiêu biểu là DHA và EPA [7]. Thịt cá hồi có giá trị dinh dưỡng cao nên được rất nhiều quốc gia quan tâm khai thác và đánh bắt, trong đó có Việt Nam. Tuy nhiên, sau khi chế biến để sử dụng phần thịt cá, rất nhiều phụ phẩm như đầu cá, xương, vây bụng và thịt thừa vẫn chưa được tận dụng phục vụ cho con người đúng cách (chủ yếu được chế biến làm thức ăn chăn nuôi). Điều này gây nên một sự lãng phí lớn bởi giá trị dinh dưỡng ở các bộ phận khác của cá không hề thua kém phần thịt cá. Chính vì vậy, nếu biết cách tận dụng được nguồn phụ phẩm rẻ tiền từ quá trình chế biến thủy sản này để tạo ra các chế phẩm giàu DHA và EPA phục vụ cho nhu cầu dinh dưỡng của con người, thì đó sẽ là một định hướng mang lại nhiều ý nghĩa tích cực. Đây chắc chắn sẽ là một vấn đề được chú trọng trong tương lai gần.
Điều đáng chú ý là trong dầu cá tự nhiên, phần lớn các axit béo nói chung và hai axit béo thiết yếu nói riêng là DHA và EPA nằm dưới dạng các gốc acyl trong triacylglycerol (triglycerid). DHA và EPA vốn là những axit béo thiết yếu, nhưng bên cạnh đó, vẫn có rất nhiều axit béo no hoặc không no một nối đôi khác không có tác dụng tốt đối với sức khỏe con người. Ý tưởng tìm cách loại bỏ các loại axit béo không cần thiết đó để làm giàu hàm lượng DHA và EPA trong dầu cá tự nhiên đã được biết đến từ khá lâu và hiện tại có rất nhiều phương pháp khác nhau để thực hiện quá trình này. Trong số đó, phương pháp sử dụng enzym lipase đã thể hiện được nhiều ưu điểm nổi trội so với các phương pháp hóa học truyền thống trước đây.
Ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm hiện đang là một trong những định hướng ứng dụng quan trọng của lipase, đặc biệt trong công nghệ sản xuất các sản phẩm có chứa hàm lượng cao các axit béo thiết yếu. Tầm quan trọng của các axit béo chưa bão hòa (PUFA) đối với chế độ dinh dưỡng thể hiện ở việc giúp ngăn ngừa rất nhiều bệnh tật. Điều này đã được khoa học chứng minh từ ba thập kỷ trước. Đặc biệt, omega-3 (trong đó có DHA và EPA) tham gia vào quá trình hình thành các hoocmon – đóng một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình phát triển của cơ thể người. Các axit béo thiết yếu này được xem là không thể thiếu cho sự phát triển của trẻ em.
Trong công nghiệp chế biến chất béo trước đây, thông thường người ta sử dụng các phương pháp hóa học để thủy phân dầu mỡ thành glycerol và các axit béo, sau đó sử dụng phương pháp vật lý để tinh sạch. Những năm gần đây, phương pháp làm giàu axit béo bằng xúc tác enzym thường được lựa chọn để thu nhận và tinh sạch các axit béo không no nhiều nối đôi, do chúng dễ bị oxy hóa và phân hủy ở nhiệt độ cao trong các quá trình chưng cất truyền thống. Chính vì vậy, enzym lipase đóng một vai trò hết sức quan trọng đối với nhóm phương pháp này.
Các phương pháp làm giàu DHA và EPA bằng lipase có những ưu điểm vượt trội so với các phương pháp vật lý và hóa học truyền thống. Bản chất của phương pháp làm giàu DHA và EPA trong dầu cá bằng lipase dựa trên đặc điểm chọn lọc axit béo và sự phân biệt của lipase đối với các PUPA ω-3 có nối đôi gần nhóm carboxyl. Đặc biệt, các lipase cố định có thể tái sử dụng mà không làm giảm đáng kể khả năng xúc tác. Điều này giúp ta thấy được hướng ứng dụng tiềm năng của loại enzym này trong lĩnh vực xử lý dầu cá nhằm mục đích làm giàu các axit béo thiết yếu.
Phần lớn lipase được sử dụng trong các nghiên cứu tính đến thời điểm này có nguồn gốc chủ yếu từ vi sinh vật. Cho đến nay, ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào ứng dụng enzym lipase từ thực vật để làm giàu DHA và EPA trong dầu cá. Vì vậy, sử dụng enzym lipase từ thực vật (đu đủ) để thủy phân dầu cá hồi nhằm tạo nên sản phẩm giàu DHA và EPA có thể nói là một định hướng mới và hứa hẹn cho kết quả khả quan, bởi các enzym từ thực vật có những ưu thế riêng so với enzym từ các nguồn khác. Bên cạnh đó, Việt Nam là một đất nước có bờ biển dài với nguồn hải sản phong phú cũng như sở hữu diện tích đất nông nghiệp rộng lớn – rất phù hợp với mục tiêu mà đề tài đang hướng đến là tận dụng những nguồn nguyên liệu sẵn có nhằm giảm giá thành sản phẩm.
Nhận thấy được tiềm năng phát triển rất lớn của nguồn lipase thực vật nói chung và từ đu đủ nói riêng, với mục đích làm sáng tỏ những đặc tính của enzym lipase từ mủ quả đu đủ cũng như khả năng ứng dụng của loại enzym này trong công nghiệp thực phẩm, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu một số đặc tính của enzym lipase từ mủ đu đủ và ứng dụng vào quá trình làm giàu DHA, EPA trong dầu cá hồi”.
– Xác định một số đặc tính của enzym lipase từ mủ quả đu đủ, bao gồm:
+ Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym trên cơ chất là dầu cá hồi.
+ Tính đặc hiệu của enzym với axit béo no/không no.
– Tối ưu hóa quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi lipase từ mủ đu đủ nhằm mục đích làm giàu hàm lượng axit béo DHA và EPA thông qua các phương pháp khác nhau.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
– Mủ đu đủ: được thu từ một số vườn đu đủ trồng tại huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam.
– Dầu cá hồi: dầu cá được tách chiết từ lường cá hồi được mua tại Công ty TNHH chế biến thực phẩm D&N, tại 01 Nguyễn Phục, Thọ Quang, Sơn Trà, Đà Nẵng.
– Nghiên cứu sử dụng các phương pháp cơ bản và phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm.
– Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa chính xác trên các đối tượng là enzym lipase được thu nhận từ đu đủ trồng tại các nhà vườn ở huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam và cá hồi có nguồn gốc tại thành phố Đà Nẵng.
– Phương pháp thu nhận mủ đu đủ
– Phương pháp thu nhận dầu cá hồi
– Phương pháp xác định chỉ số acid
– Phương pháp xác định chỉ số xà phòng hóa
– Phương pháp xác định hoạt độ của lipase đối với cơ chất dầu cá hồi:
+ Phương pháp chuẩn độ
+ Phương pháp đo quang
– Phương pháp xác định tính đặc hiệu của lipase với các loại axit béo
– Phương pháp làm giàu DHA và EPA trong dầu cá hồi xúc tác bởi enzym lipase thô từ mủ đu đủ
– Phương pháp xác định hàm lượng axit béo trong dầu cá.
Và một số phương pháp thực nghiệm khác.
4.3. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu
5.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
– Xác định một số đặc tính của enzym lipase thu được từ mủ quả đu đủ ở Đại Lộc, Quảng Nam, trong đó có tính đặc hiệu của loại enzym này đối với axit béo no hoặc không no (là kết quả chưa từng được công bố trước đó).
– Xác định được một số đặc tính cơ bản của dầu cá hồi.
– Đánh giá hiệu quả của quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng lipase từ mủ quả đu đủ nhằm mục đích làm giàu hàm lượng DHA và EPA trong dầu cá.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
– Tận dụng được nguồn nguyên liệu sẵn có và rẻ tiền.
– Làm giàu hàm lượng DHA và EPA trong dầu cá hồi để sản xuất ra những sản phẩm đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng và chăm sóc sức khỏe của người tiêu dùng với giá trị cao.
– Tạo công ăn việc làm cho người nông dân và ngư dân.
– Nguồn gốc enzym từ tự nhiên sẽ đảm bảo an toàn cho người sử dụng, rất thích hợp để ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm.
Luận văn có bố cục cụ thể như sau:
Mở đầu
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Vật liệu và phương pháp
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Kết luận và kiến nghị
Tài liệu tham khảo
Phụ lục
1.1. TỔNG QUAN VỀ ENZYM LIPASE
1.1.5.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xúc tác bởi enzym
1.1.6. Ứng dụng của enzym lipase
1.1.7. Ưu thế của phản ứng được xúc tác bởi lipase
1.1.9.1. Sơ lược về lipase thực vật
1.1.9.2. Vài đặc điểm của cây đu đủ
1.1.9.3. Mủ đu đủ và lipase từ mủ đu đủ
1.2. DẦU CÁ VÀ NGUỒN DINH DƯỠNG TỪ DẦU CÁ
1.2.2. Nguồn dinh dưỡng từ dầu cá: Omega-3
1.2.3. Dầu cá hồi – nguồn cung cấp DHA, EPA
1.3. ỨNG DỤNG LIPASE LÀM GIÀU DHA, EPA TRONG DẦU CÁ
Dựa trên hai phản ứng đặc trưng nhất của lipase là phản ứng thủy phân (hydrolysis) và ester hóa (esterification), có hai phương pháp làm giàu DHA, EPA tương ứng hiện vẫn được dùng phổ biến.
1.3.1. Phản ứng thủy phân dầu cá
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
Hiện trên thế giới vẫn chưa có công trình cụ thể nào về khả năng ứng dụng sửa đổi cấu trúc – làm giàu DHA, EPA từ nguồn chất béo là dầu cá hồi bởi enzym lipase từ một loại thực vật phổ biến là đu đủ. Nghiên cứu của chúng tôi nhằm làm sáng tỏ thêm đặc tính của enzym lipase khi hoạt động trên một cơ chất cụ thể là dầu cá hồi, cũng như kiểm tra tính hiệu quả của việc làm giàu DHA, EPA trong dầu cá nhờ enzym từ đu đủ nói riêng, thực vật nói chung.
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp thu nhận enzym lipase từ mủ đu đủ
2.2.1.2. Thu nhận enzym thô từ mủ đu đủ
2.2.2. Phương pháp thu nhận dầu cá hồi
2.2.3. Phương pháp vật lý và hóa lý
2.2.3.1. Xác định khối lượng mẫu
2.2.4.1. Phương pháp xác định chỉ số acid
2.2.4.2. Phương pháp xác định chỉ số xà phòng hóa
2.2.4.3. Phương pháp đo quang xác định hoạt độ của lipase thô
2.2.4.4. Phương pháp chuẩn độ xác định hoạt độ của lipase đối với cơ chất dầu cá hồi
2.2.4.5. Phương pháp xác định tính đặc hiệu axit béo của lipase đối với cơ chất
– Phương pháp đo hoạt độ bằng chuẩn độ.
– Phương pháp so sánh hoạt độ bằng đĩa thạch.
2.2.4.6. Phương pháp xác định ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt độ lipase
2.2.4.7. Phương pháp thủy phân làm giàu DHA và EPA trong dầu cá hồi bằng enzym lipase
– Hiệu suất thủy phân [23]: được tính theo công thức:
2.2.4.8. Phương pháp ester hóa kết hợp phương pháp kết tinh với ure làm giàu DHA, EPA trong dầu cá hồi bằng enzym lipase
– Dạng sản phẩm sau phản ứng: được đánh giá thông qua hiệu suất ester hóa (%).
– Hiệu suất thu hồi DHA, EPA sau phản ứng (DHA/EPA recovery):
– Hiệu quả làm giàu DHA, EPA:
2.2.4.9. Phương pháp xác định hàm lượng axit béo trong dầu cá
2.2.5. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm
2.2.6. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu
3.1. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYM LIPASE TỪ MỦ ĐU ĐỦ
3.1.1. Đánh giá hiệu suất thu nhận
3.1.2. Đánh giá hoạt độ của chế phẩm lipase thô từ mủ đu đủ
3.1.2.1. Xác định thời gian đo hoạt độ
Trong phản ứng xúc tác với enzym, hoạt độ enzym sẽ tăng dần theo thời gian, nhưng mức độ tăng khác nhau. Có một khoảng thời gian xác định mà tại đó, mức độ thay đổi hoạt độ theo thời gian là lớn nhất. Lúc này, vận tốc phản ứng là cao nhất, mức hoạt độ đo được tại thời điểm này phản ánh chính xác hoạt lực của enzym.
Tiến hành thí nghiệm đo hoạt độ tại các mốc thời gian khác nhau. Kết quả sự biến thiên của chỉ số acid theo thời gian được thể hiện đồ thị hình 3.2.
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi vận tốc phản ứng (∆V/t) theo thời gian
Kết luận: thời gian tối ưu để xác định hoạt lực enzym lipase từ mủ đu đủ trên cơ chất dầu cá hồi là 15 phút.
3.1.2.2. Hoạt độ của chế phẩm lipase thô từ mủ đu đủ
3.1.3. Nghiên cứu tính đặc hiệu của chế phẩm lipase thô từ mủ đu đủ
3.1.3.1. Xác định tính đặc hiệu bằng phương pháp chuẩn độ
Tiến hành xác định hoạt độ của enzym lipase từ mủ đu đủ trên những cơ chất khác nhau. Kết quả thể hiện trên biểu đồ hình 3.3:
Dầu đậu nành
Loại cơ chất
Hình 3.3. Hoạt độ lipase mủ đu đủ trên các loại cơ chất khác nhau
Thứ tự hoạt độ enzym trên cơ chất khác nhau:
Triglycerid của axit béo bất bão hòa đa > Triglycerid của axit béo bất bão hòa đơn > Triglycerid của axit béo no
Kết luận: enzym lipase mủ đu đủ có tính đặc hiệu đối với các triglycerid có thành phần là các axit béo không no nhiều nối đôi trong phân tử.
3.1.3.2. Xác định tính đặc hiệu bằng phương pháp đĩa thạch
Phương pháp đĩa thạch: là phương pháp định tính, dễ quan sát, sử dụng để kiểm chứng lại hoạt độ của enzym lipase từ mủ đu đủ.
– So với lipase khác: hoạt độ của lipase đu đủ thể hiện khá tốt (hình 3.4)
- (b) (c)
Hình 3.4. Hoạt độ trên cùng cơ chất dầu cá hồi của hai loại lipase khác nhau; hình (a) lipase thương mại; hình (b) lipase thô; hình (c) không dùng lipase
– Quan sát hoạt động của lipase trên hai cơ chất là triolein và dầu cá hồi: hoạt độ của lipase đu đủ thể hiện cao hơn trên cơ chất dầu cá hồi.
(a) (b)
Hình 3.5. Hoạt độ trên hai đĩa cơ chất khác nhau của lipase từ mủ đu đủ;
hình (a) cơ chất triolein; hình (b) cơ chất dầu cá hồi
Kết luận: enzym lipase mủ đu đủ có tính đặc hiệu đối với các triglycerid có thành phần là các axit béo không no nhiều nối đôi trong phân tử.
3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt độ enzym lipase thô trên cơ chất dầu cá hồi
3.1.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của enzym lipase thô từ mủ đu đủ
Khảo sát hoạt độ của enzym lipase từ mủ đu đủ trên cơ chất dầu cá hồi tại các mức nhiệt độ khác nhau để tìm ra mức nhiệt độ tối ưu của enzym. Kết quả thể hiện qua đồ thị hình 3.6.
134,45c
Nhiệt độ (oC)
81,11d
94,44c,d
255,56a
198,89b
188,89b
134,44c
Nhiệt độ (oC)
Hình 3.6. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của các mức nhiệt độ khác nhau đến hoạt độ enzym
Kết luận: mức nhiệt độ tối ưu là 45oC.
3.1.4.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của enzym lipase thô từ mủ đu đủ
Khảo sát hoạt độ của enzym lipase từ mủ đu đủ trên cơ chất dầu cá hồi tại các mức pH khác nhau để tìm ra mức pH tối ưu cho enzym. Kết quả thể hiện qua đồ thị hình 3.7.
187,78c,d
207,78b,c
213,33b,c
226,67b
262,22a
231,11b
224,45b
204,44b,c
193,33c,d
Hình 3.7. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của các mức pH khác nhau đến hoạt độ enzym
Kết luận: mức pH tối ưu bằng 8.
3.2. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG LIPASE MỦ ĐU ĐỦ ĐỂ LÀM GIÀU DHA VÀ EPA TRONG DẦU CÁ HỒI
3.2.1. Một số đặc điểm của dầu cá hồi thô
3.2.1.1. Xác định các chỉ số chất lượng của dầu cá hồi thô
Đã xác định được một số chỉ số chất lượng của dầu cá hồi thô.
3.2.1.2. Xác định thành phần axit béo có trong dầu cá hồi
Đã xác định được thành phần axit béo có trong dầu cá hồi, trong đó DHA chiếm 4,11% và EPA chiếm 4,03%.
3.2.2. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzym lipase từ mủ đu đủ để làm giàu DHA, EPA
Một trong những xu hướng ứng dụng quan trọng của enzyme lipase hiện nay là làm giàu các axit béo omega-3 có lợi có sức khỏe (đặc biệt là DHA và EPA) từ nguồn nguyên liệu sẵn có (các loại dầu cá). Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn dầu cá hồi là nguồn nguyên liệu chính để thực hiện quá trình làm giàu.
Trong phần trình bày dưới đây, chúng tôi sử dụng hai đặc tính xúc tác của lipase để phục vụ cho nghiên cứu, bao gồm đặc tính xúc tác cho phản ứng ester hóa giữa axit béo và ancol (3.2.2.1); và đặc tính xúc tác cho phản ứng thủy phân chất béo (3.2.2.2). Đây là hai phản ứng có chiều nghịch nhau [48], chính việc tận dụng được đặc điểm xúc tác cho cả hai loại phản ứng này khiến ứng dụng của enzym lipase trở nên linh hoạt và đa dạng.
3.2.2.1. Làm giàu theo phương pháp tạo kết tinh với ure kết hợp ester hóa bằng lipase từ mủ đu đủ
Phương pháp dựa trên tính xúc tác cho phản ứng ester hóa của enzym lipase.
Quy trình của phương pháp:
Bước 1: Thực hiện xà phòng hóa dầu cá bằng dung dịch kiềm đặc nhằm thủy phân toàn bộ các axit béo có trong dầu cá, tách hỗn hợp axit béo này khỏi hỗn hợp, sau đó axit hóa trở lại để thu các axit béo này dưới dạng tự do.
Bước 2: Tiến hành loại bỏ các axit béo no ra khỏi hỗn hợp bằng phương pháp kết tinh với ure. Các axit béo không cần thiết này sẽ phản ứng với ure tạo kết tủa. Lọc bỏ kết tủa, thu được hỗn hợp các axit béo bất bão hòa (trong đó có DHA, EPA).
Bước 3: Thực hiện phản ứng ester hóa giữa hỗn hợp các axit béo bất bão hòa đa với glycerol dưới sự xúc tác của enzym lipase từ mủ đu đủ. Đánh giá hiệu quả của phương pháp.
a) Xây dựng đường chuẩn xác định hàm lượng DHA, EPA dạng tự do trong dầu cá
Đã xây dựng được đồ thị đường chuẩn DHA và EPA với hệ số tương quan cao, thích hợp để đánh giá hàm lượng DHA, EPA tự do trong mẫu bằng phương pháp HPLC.
b) Nghiên cứu xác định điều kiện kết tủa axit béo trong dầu cá bằng ure
Mô hình thực nghiệm bậc 2 tâm trực giao của Box-Wilson được lựa chọn nhằm tìm kiếm các yếu tố ảnh hưởng phù hợp, sao cho khối lượng kết tủa thu được là lớn nhất.
Hàm mục tiêu là: khối lượng kết tủa sau phản ứng với ure (để loại bỏ được nhiều nhất các loại axit béo no và không no một nối đôi).
Hai yếu tố ảnh hưởng được lựa chọn là:
– Z1: Tỉ lệ ure : axit béo
– Z2: Thời gian phản ứng
Tiến hành các thí nghiệm theo quy hoạch đề ra, phân tích dữ liệu và tìm ra phương trình hồi quy thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố đến mục tiêu như sau:
Y=2.1347 – 0.4667.x1 + 0.1332.
Phương trình hồi quy được đánh giá là phù hợp. Dựa vào phương trình hồi quy, tìm được giá trị của hai biến ảnh hưởng sao cho giá trị của hàm mục tiêu lớn nhất; đó là tỉ lệ ure : axit béo = 3:1 và thời gian phản ứng là 8 giờ.
c) Đánh giá hiệu quả của phương pháp
– Thực hiện quy trình làm giàu với điều kiện tối ưu, xác định hàm lượng DHA tại các thời điểm khác nhau để tính toán.
– Lúc đầu, 50 g dầu cá được đem đi tiến hành quá trình làm giàu, với 4,11% là DHA và 4,03% là EPA (phần 3.2.1.2), từ đó tính được khối lượng DHA và EPA thực tế trong mẫu ban đầu lần lượt là 2,055 g và 2,015 g.
– Đến giai đoạn kết thúc quá trình ure loại bỏ các axit béo no (kết thúc bước 2), thể tích mẫu thu được là 9,2 ml với khối lượng là 8,9 g. Lúc này, tiến hành chạy HPLC đo được nồng độ DHA trong mẫu là 0,44M. Dễ dàng tính được khối lượng DHA có trong mẫu là:
mDHA = nDHA. MDHA = CDHA. VddDHA. MDHA = 0,44. 9,2. 10-3. 328,5 = 1,33 g
Tương tự tính được:
mEPA = nEPA. MEPA = CEPA. VddEPA. MEPA = 0,176. 9,2. 10-3. 302,45 = 0,49 g
(Trong đó: m là khối lượng chất, n là số mol chất, M là khối lượng mol chất (phân tử lượng), C là nồng độ chất và Vdd là thể tích dung dịch).
– Hiệu suất thu hồi DHA (DHA recovery) sau cả quá trình như sau:
– Hiệu suất của quá trình ester hóa của mỗi loại axit béo (hiệu suất bước 3) căn cứ vào nồng độ DHA và EPA trước và sau phản ứng ester hóa:
Tỉ lệ 75,5% và 65,34% là tỉ lệ chuyển hóa khá tốt đối với kiểu phản ứng này.
– Tỉ lệ phần trăm của DHA trong hỗn hợp cuối cùng sau ester hóa:
Tỉ lệ này có thể tăng cao đến 9,1%, tương ứng với mức làm giàu là 1,84 lần nếu loại bỏ glycerol dư sau phản ứng ester hóa.
3.2.2.2. Làm giàu theo hương pháp thủy phân bằng xúc tác lipase từ mủ đu đủ
Phương pháp dựa trên tính xúc tác cho phản ứng thủy phân của enzym lipase.
– Hiệu suất của quá trình thủy phân (DH – degree of hydrolysis) được dùng để đánh giá quá trình thủy phân.
– Khi thực hiện phản ứng thủy phân dầu cá bằng enzym lipase, chỉ cần mức độ thủy phân (DH) của phản ứng đạt khoảng 50% là đạt yêu cầu.
a) Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ enzym/cơ chất đến hiệu suất thủy phân
Tiến hành các phản ứng thủy phân với tỉ lệ enzym/cơ chất khác nhau, lần lượt là 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%. Đo hiệu suất thủy phân tương ứng. Kết quả thu được ở hình 3.18.
Tỉ lệ enzym/cơ chất (%)
54,11f
52,50e
51,98e
50,71d
49,26c
46,05b
42,33a
Hình 3.18. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của các mức tỉ lệ enzym/cơ chất đến hiệu suất thủy phân
Kết luận: tỉ lệ enzym/cơ chất phù hợp là 4% với mức hiệu suất thủy phân tương ứng là 50,71%.
b) Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất thủy phân
Tiến hành phản ứng thủy phân tại các mốc thời gian khác nhau; lần lượt là 4 giờ, 8 giờ, 12 giờ, 16 giờ, 20 giờ, 24 giờ, 28 giờ, 32 giờ. Đo hiệu suất thủy phân tương ứng. Kết quả thu được ở hình 3.20.
54,50f
54,53f
51,42e
50,21e
47,82d
45,24c
43,08b
38,24a
Hình 3.20. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất thủy phân
Kết luận: 20 giờ là khoảng thời gian tối ưu để thực hiện phản ứng thủy phân dầu cá hồi dưới xúc tác của enzym lipase từ mủ đu đủ, với mức hiệu suất thủy phân tương ứng là 50,21%.
c) Đánh giá hiệu quả của phương pháp
– Dựa trên hàm lượng DHA, EPA trước và sau phản ứng thủy phân, có thể kết luận enzym lipase từ mủ đu đủ là một enzym đặc hiệu với DHA.
– Hiệu suất thủy phân đối với DHA:
3.2.2.3. Đánh giá hai phương pháp làm giàu
Trình bày, so sánh một số ưu, nhược điểm của hai phương pháp làm giàu.
1. Đã nghiên cứu được một số đặc tính của enzym lipase từ mủ đu đủ:
– Hiệu suất thu nhận enzym lipase từ mủ đu đủ là 19,31%.
– Thời gian tối ưu để xác định hoạt độ là 15 phút, với mức hoạt độ tương ứng trên cơ chất dầu cá hồi là 232,41U/g.
– Enzym có tính đặc hiệu đối với chất béo của các axit béo không no, nhiều nối đôi.
– Xác định được mức nhiệt độ và pH hoạt động tối ưu cho enzym lipase trên cơ chất dầu cá hồi lần lượt là 45oC và 8.
2. Đã nghiên cứu ứng dụng lipase từ mủ đu đủ để làm giàu DHA, EPA trong dầu cá hồi:
– Xác định được một số đặc điểm của dầu cá hồi, bao gồm các chỉ số chất lượng và thành phần axit béo trong dầu cá.
– Làm giàu bằng phương pháp kết tinh với ure kết hợp ester hóa: xác định được tỉ lệ ure : axit béo và thời gian tối ưu trong phản ứng kết tinh với ure lần lượt là 3/1 và 8 giờ. Mức độ làm giàu DHA trong sản phẩm là 1,84 lần so với dầu cá ban đầu, hiệu suất thu hồi axit béo 64,88%. Tỉ lệ DHA, EPA chuyển thành dạng glycerid lần lượt đạt 75,50% và 65,34%.
– Làm giàu bằng phương pháp thủy phân: xác định được mức tỉ lệ enzym/cơ chất và thời gian để hiệu suất phản ứng đạt 50% lần lượt là 4% và 20 giờ. Hiệu suất thủy phân DHA đạt 63,30%.
1. Nghiên cứu bổ sung thêm một số đặc tính khác của enzym lipase từ mủ đu đủ, hoàn thiện các kết quả hiện có.
2. Nghiên cứu phương pháp tối ưu loại bỏ glycerol trong cách làm giàu theo phương pháp kết tinh với ure kết hợp ester hóa.
3. Tiếp tục quy trình tách và làm giàu DHA trong cách làm giàu theo phương pháp thủy phân.
4. Tối ưu thêm các thông số khác trong hai phương pháp làm giàu hiện có nhằm nâng cao hiệu quả so với hiện tại.
5. Tiến hành nghiên cứu phương pháp làm giàu mới dựa trên phản ứng transester hóa.
6. Đánh giá chất lượng sản phẩm thu được sau các quá trình làm giàu với mục tiêu sử dụng làm thực phẩm. Có thể tiến hành nghiên cứu ở quy mô lớn hơn, đẩy nhanh quá trình ứng dụng trong thực tế.
E:\DỮ LIỆU COP CỦA CHỊ YẾN\DAI HOC DA NANG\CONG NGHE SINH HỌC\CONG NGHE SINH HOC\NGUYEN DINH HAI NAM
