Nghiên cứu chiết tách xác định thành phần hóa học trong dịch chiết ethanol – nước của cây cỏ sữa lá nhỏ theo định hướng hạ đường huyết
Ngày nay, theo thống kê của Hiệp hội Đái tháo đường Quốc tế, tính đến năm 2013, toàn thế giới có khoảng 382 triệu người mắc bệnh đái tháo đường, và con số này có xu hướng tăng lên gấp đôi vào năm 2035, chi phí điều trị dành cho bệnh đái tháo đường ở nhóm bệnh nhân 20-79 tuổi trên thế giới đạt mức 548 tỷ USD [20]. Hiện nay, trên thị trường các thuốc điều trị đái tháo đường chủ yếu có nguồn gốc tổng hợp hóa dược, việc nghiên cứu các thuốc mới có nguồn gốc từ thiên nhiên đã và đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu nhằm tìm kiếm các thuốc có tác dụng hỗ trợ cho bệnh nhân trong quá trình điều trị kéo dài, giảm tác dụng không mong muốn, đồng thời giảm chi phí điều trị.
Ở Việt Nam, cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolia L., họ Euphorbiaceae) mọc hoang ở khắp nơi, ưa đất có sỏi, đá, thường thấy ở các kẽ gạch, sân xi măng, dọc đường xe lửa có dải những hòn đá vôi xanh. Trên thế giới, cỏ sữa lá nhỏ cũng mọc hoang ở một số nước như Bangladesh, Ấn Độ. Theo y học cổ truyền, cỏ sữa lá nhỏ được sử dụng để chữa lỵ, nhất là ở trẻ em [13]; tăng huyết áp, … [32]. Lá và hạt cỏ sữa lá nhỏ được sử dụng trong chứng rối loạn đường ruột ở trẻ em và là thuốc nhuận tràng [27]. Đồng thời, hoạt tính kháng khuẩn của cỏ sữa lá nhỏ đã được phát hiện từ năm 1988 [25].
Cây cỏ sữa lá nhỏ đã được các nhà khoa học trên thế giới và Việt Nam quan tâm nghiên cứu. Theo Vũ Minh Trang, từ cặn chiết ethylacetat của lá cây cỏ sữa lá nhỏ thu hái ở Hà Nội đã phân lập được các chất: apigenin, quercetin, methyl gallate, acid gallic và apigenin 7-O-β-D-glucopyranoside cùng với acid palmitic và β-sitosterol [17]. Bên cạnh đó, tác giả này cũng đã phân lập được một số thành phần dipeptide và glucoside từ lá cỏ sữa lá nhỏ, trong đó luteolin-7-O-β-D-glucopyranoside là hợp chất chính có trong phần chiết nước [18]. Một số kết quả nghiên cứu sơ bộ tại Việt Nam đã cho thấy cây cỏ sữa lá nhỏ có tác dụng hạ đường huyết [28] và được nhân dân sử dụng dưới dạng nước uống hằng ngày [13].
Với những lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học trong dịch chiết ethanol – nước của cây cỏ sữa lá nhỏ theo định hướng hạ đường huyết” đã được lựa chọn.
1. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của cỏ sữa lá nhỏ thu hái tại huyện Thăng Bình – tỉnh Quảng Nam.
2. Xác định thành phần hóa học trong dịch chiết ethanol – nước của cây cỏ sữa lá nhỏ theo định hướng hạ đường huyết.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Toàn cây Cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolia L.) được thu hái tại huyện Thăng Bình – tỉnh Quảng Nam vào tháng 5 năm 2016.
Đề tài được thực hiện với các phương pháp sau:
4.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết
– Thu thập, tổng hợp tài liệu, tư liệu và các thông tin liên quan đến đề tài
– Tìm hiểu về các phương pháp thực nghiệm sử dụng trong quá trình nghiên cứu
– Xử lý các thông tin về lý thuyết có thể sử dụng được để đưa ra các vấn đề cần thực hiện trong quá trình thực nghiệm
4.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
– Lấy mẫu, xử lý và sơ chế mẫu
– Xác định một số chỉ tiêu hóa lý của cỏ sữa lá nhỏ:
+ Xác định độ ẩm, hàm lượng tro bằng phương pháp trọng lượng.
+ Xác định hàm lượng kim loại nặng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS).
– Chiết tách các chất trong cây cỏ sữa lá nhỏ bằng phương pháp ngâm lạnh, phương pháp chiết nóng với dung môi ethanol – nước.
– Xác định các nhóm hoạt chất trong các dịch chiết bằng các phản ứng hóa học đặc trưng theo qui trình phân tích thành phần hóa thực vật của bộ môn Dược liệu, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh.
– Thử tác dụng hạ đường huyết trên chuột của dịch chiết cỏ sữa lá nhỏ.
– Chiết tách, phân lập, tinh chế các chất trong cây cỏ sữa lá nhỏ bằng phương pháp chiết phân phân đoạn với các dung môi và sắc ký cột.
– Xác định thành phần hóa học các chất dễ bay hơi trong dịch chiết của các phân đoạn bằng sắc ký khí ghép khối phổ GC – MS.
– Xác định cấu trúc hóa học của chất tinh chế được bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối lượng (MS).
4.3. Xử lý số liệu
– Các số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê, sử dụng excel 2007.
Ngoài phần mở đầu (3 trang), kết luận và kiến nghị (2 trang), tài liệu tham khảo (5 trang), luận văn gồm 16 bảng, 6 hình và 4 chương như sau:
Chương 1: Tổng quan (17 trang)
Chương 2: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu (8 trang)
Chương 3: Kết quả và thảo luận (23 trang)
1.1. VÀI NÉT VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ CÂY CỎ SỮA LÁ NHỎ
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CỎ SỮA LÁ NHỎ
1.2.2. Nghiên cứu trên thế giới
1.3. NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CỎ SỮA LÁ NHỎ
1.3.1. Tác dụng hạ đường huyết
1.3.3. Tác dụng kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm, kháng sinh, kháng viêm
1.3.4. Tác dụng chống oxy hóa, gốc tự do
1.3.6. Tác dụng lợi tiểu, nhuận tràng
1.4. CÔNG DỤNG CỦA CỎ SỮA LÁ NHỎ
1.5. MỘT SỐ DƯỢC LIỆU CÓ TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu nghiên cứu là toàn cây Cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolia L.) được thu hái ở khu vực huyện Thăng Bình – Quảng Nam vào tháng 05 năm 2016.
Hình 2.1. Cỏ sữa lá nhỏ đã xử lý
2.1.2. Hoá chất – dung môi, thiết bị
2.1.4. Địa điểm nghiên cứu
2.2.1. Xác định các thông số hoá lý
b. Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp tro hóa mẫu
c. Xác định hàm lượng một số kim loại nặng bằng phương pháp hấp thụ nguyên tử (AAS)
2.2.2. Nghiên cứu thành phần hoá học
2.2.3. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết
2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
CHƯƠNG 3
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HOÁ LÝ
Độ ẩm trung bình của mẫu nguyên liệu cỏ sữa lá nhỏ xác định được là 9,64%.
3.1.2. Độ tro toàn phần
Độ tro toàn phần trung bình của mẫu nguyên liệu cỏ sữa lá nhỏ xác định được là 7,82%.
3.1.3. Hàm lượng kim loại nặng
Bảng 3.3. Hàm lượng kim loại nặng trong mẫu cỏ sữa lá nhỏ
| STT | Chỉ tiêu | Kết quả (mg/kg) | Hàm lượng cho phép (mg/kg) |
| 1 | Hg | Không phát hiện (< 0,05) | 0,050 |
| 2 | As | 0,18 | 1,000 |
| 3 | Pb | Không phát hiện (< 0,1) | 2,000 |
| 4 | Cd | 0,96 | 1,000 |
3.2. KẾT QUẢ THỬ TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT CỦA CÂY CỎ SỮA LÁ NHỎ
3.2.1. Kết quả chiết xuất dược liệu
Toàn cây cỏ sữa lá nhỏ được rửa sạch, thái nhỏ, phơi và sấy khô ở 600C. Lấy 0,5 kg mẫu ngâm chiết với 2,5 lít ethanol 96% 3 lần, sau đó gộp các dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến khi được cao 5:1 thu được cao chiết ET1. Tiến hành tương tự với các dung môi ethanol 80%, ethanol 50% thu được cao chiết ET2, ET3.
Lấy 0,5 kg mẫu chiết nóng với 2,5 lít nước cất 3 lần, sau đó gộp các dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến khi được cao 5:1 thu được cao chiết ET4.
Cân khối lượng các cao chiết thu được, từ đó tính hiệu suất chiết của các dung môi.
Bảng 3.4. Kết quả hiệu suất chiết cỏ sữa lá nhỏ trong dung môi EtOH/H2O
Nhận xét: Kết quả Bảng 3.4 cho thấy hiệu suất chiết xuất các hợp chất từ cây cỏ sữa lá nhỏ rất thấp và hiệu suất chiết tỉ lệ thuận với độ phân cực của dung môi chiết.
3.2.2. Kết quả thử tác dụng hạ đường huyết của cỏ sữa lá nhỏ
Chia chuột thành các lô gồm: 1 lô chứng trắng; 1 lô chứng dương; 4 lô thử (uống hỗn dịch cao chiết dược liệu với liều 6g/kg của 4 mẫu cao chiết ET1, ET2, ET3 và ET4). So sánh sự thay đổi đường huyết của các lô sau thời gian điều trị, kết quả trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Sự thay đổi đường huyết của các lô chuột uống Euphorbia thymifolia L
| Lô | Đường huyết (mmol/l) | Tỷ lệ hạ đường huyết (%) | p so với lô | |||
| Ngày 0 | Ngày 7 | 1 | 2 | |||
| 1 | Chứng trắng | 15,41,1 | 15,11,2 | 2,560,99 | ||
| 2 | Chứng dương | 16,61,8 | 9,60,9 | 41,731,85 | p2,1<0,001 | |
| 3 | ET1 | 14,61,6 | 10,00,7 | 28,042,77 | p3,1<0,001 | p3,2<0,001 |
| 4 | ET2 | 14,21,6 | 10,21,0 | 30,331,25 | P4,1<0,001 | P4,2<0,001 |
| 5 | ET3 | 14,81,2 | 10,50,9 | 32,801,94 | p5,1<0,001 | P5,2<0,001 |
| 6 | ET4 | 14,90,7 | 10,50,7 | 25,001,36 | p6,1<0,001 | P6,2<0,001 |
Nhận xét: Kết quả Bảng 3.5 cho thấy các mẫu Euphorbia thymifolia L. đều có tác dụng làm tăng tỉ lệ hạ đường huyết so với lô chứng trắng (p < 0,001). Tác dụng hạ đường huyết cao nhất là của mẫu ET3 (32,8%). So với lô chứng dương, mức hạ đường huyết của các lô mẫu thử thấp hơn (p < 0,001).
3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC
3.3.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cây cỏ sữa lá nhỏ
Bảng 3.6. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cây cỏ sữa lá nhỏ
| STT | Nhóm hợp chất | Phản ứng định tính | Kết quả | Kết luận |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Flavonoid | Phản ứng Cyanidin Phản ứng với: Dung dịch NaOH 10% Dung dịch FeCl3 5% | +++ +++ +++ | Có |
| 2 | Alcaloid | Phản ứng với thuốc thử: Mayer Bouchardat Dragendorff | – – – | Không có |
| 3 | Saponin | Phản ứng với H2SO4 đậm đặc Hiện tượng tạo bọt | ++ ++ | Có |
| 4 | Anthranoid | Phản ứng Borntraeger | ++ | Có |
| 5 | Tannin | Phản ứng với: Dung dịch Gelantin 1% Dung dịch FeCl3 5% | ++ +++ | Có |
| 6 | Đường khử | Phản ứng với thuốc thử Fehling A + Fehling B | ++ | Có |
| 7 | Carotenoid | Phản ứng với H2SO4 đậm đặc | ++ | Có |
| 8 | Phytosterol | Phản ứng Lieberman | ++ | Có |
| 9 | Chất béo | Để lại vết mờ trên giấy lọc | + | Có |
| 10 | Acid hữu cơ | Phản ứng với Na2CO3 tinh thể | – | Không có |
| 11 | Coumarin | Phản ứng đóng mở vòng lacton | – | Không có |
| 12 | Tinh dầu | Mùi thơm | + | Có |
| 13 | Glycosid tim | Phản ứng Libermann Phản ứng Baljet Phản ứng Legal Phản ứng Keller-kiliani | – – – – | Không có |
| 14 | Acid amin | Thuốc thử Ninhydrin 0,1% | + | Có |
Ghi chú: (-): Phản ứng âm tính. (+): Phản ứng dương tính.
(++): Phản ứng rõ. (+++): Phản ứng rất rõ
3.3.2. Kết quả định tính flavonoid trong cắn phân đoạn chiết bằng phản ứng hoá học
Lấy khoảng 500g nguyên liệu, chiết bằng phương pháp ngâm lạnh dùng dung môi ethanol 50%. Dịch chiết thu được đem lọc và cất thu hồi dung môi ethanol ở áp suất giảm đến cao. Cao thu được phân tán vào 1000 ml nước và tiến hành chiết lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexane, CH2Cl2, EtOAc. Cô thu hồi dung môi các dịch chiết thu được dưới áp suất giảm thu được các cao n-hexane, cao CH2Cl2, cao EtOAc và cao nước. Hoà tan các cao bằng ethanol 96%.
– Kết quả định tính flavonoid:
Bảng 3.7. Kết quả định tính flavonoid trong cao các
phân đoạn chiết
| Phản ứng định tính | Cao | |||
| n-hexane | CH2Cl2 | EtOAc | Nước | |
| Với thuốc thử Cyanidin | – | + | +++ | + |
| Với NaOH 10% | – | ++ | +++ | ++ |
| Với hơi ammoniac | – | + | +++ | + |
| Với FeCl3 5% | – | ++ | +++ | ++ |
| Kết quả | Không có | Có | Có | Có |
Nhận xét: Kết quả định tính ở Bảng 3.7 cho thấy cao CH2Cl2, EtOAc, nước đều có flavonoid, cao EtOAc cho phản ứng rõ nhất.
3.3.3. Xác định thành phần hoá học các chất dễ bay hơi của cỏ sữa lá nhỏ trong các dung môi hữu cơ
Toàn cây cỏ sữa lá nhỏ được rửa sạch, thái nhỏ, phơi và sấy khô ở 500C. Lấy 1 kg mẫu ngâm chiết với 5 lít ethanol 50% 3 lần, sau đó gộp các dịch chiết lại, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm được 46g cao đậm đặc. Phân tán cao đậm đặc này vào 1 lít nước cất rồi tiến hành chiết lần lượt bằng n-hexane, CH2Cl2 và EtOAc với 1 lít mỗi dung môi 2 lần. Các dịch chiết n-hexane, CH2Cl2 và EtOAc được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm rồi và cô đến kiệt dung môi được cao n-hexane (15,4g), cao CH2Cl2 (2,0g), cao EtOAc (2,4g). Dịch chiết nước được đưa lên cột diaion HP-20 để loại muối, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm rồi cô đến kiệt dung môi được cao nước (5,0g).
Các cao n-hexane, CH2Cl2, EtOAc và cao nước được phân tích, xác định thành phần hoá học các chất dễ bay hơi bằng phương pháp GC-MS.
Quy trình chiết các phân đoạn được tóm tắt theo Hình 3.1.
Hình 3.1. Sơ đồ chiết các phân đoạn
a. Thành phần hoá học các chất dễ bay hơi trong dịch chiết n-hexane
Bảng 3.8. Thành phần hoá học các chất dễ bay hơi của cỏ sữa lá nhỏ trong dịch chiết n – hexane
| STT | Thời gian lưu (phút) | % Diện tích pic | Tên hợp chất |
|---|---|---|---|
| 1 | 25,923 | 0,24 | Tetradecanoic acid |
| 2 | 30,017 | 0,52 | Methyl hexadecanoate |
| 3 | 31,205 | 10,25 | n-Hexadecanoic acid |
| 4 | 31,677 | 0,17 | Ethyl hexadecanoate |
| 5 | 34,557 | 0,16 | (Z,Z)-9,12-Octadecadienoic acid, methyl ester |
| 6 | 35,185 | 0,47 | Phytol |
| 7 | 36,347 | 6,18 | (Z,Z,Z)-9,12,15-Octadecatrienoic acid |
| 8 | 36,949 | 1,19 | Octadecanoic acid |
| 9 | 39,460 | 0,16 | Eicosanoic acid |
| 10 | 40,856 | 0,26 | Docosanoic acid |
| 11 | 44,395 | 0,15 | -Tocopherol |
| 12 | 45,272 | 0,84 | Vitamin E |
| 13 | 46,600 | 0,98 | Campesterol |
| 14 | 47,041 | 1,04 | Stigmasterol |
| 15 | 47,985 | 7,05 | -Sitosterol |
b. Thành phần hoá học các chất dễ bay hơi trong dịch chiết CH2Cl2
Bảng 3.9. Thành phần hoá học các chất dễ bay hơi của cỏ sữa lá nhỏ trong dịch chiết CH2Cl2
| STT | Thời gian lưu (phút) | % Diện tích pic | Tên hợp chất |
|---|---|---|---|
| 1 | 7,078 | 0,55 | Benzaldehyde |
| 2 | 8,432 | 0,38 | Benzyl alcohol |
| 3 | 10,969 | 0,19 | Benzoic acid |
| 4 | 14,430 | 1,09 | 2-Methoxy-4-vinylphenol |
| 5 | 24,807 | 0,58 | Benzaldehyde, 4-ethoxy- |
| 6 | 30,012 | 1,04 | Methyl hexadecanoate |
| 7 | 30,914 | 6,47 | n-Hexadecanoic acid |
| 8 | 35,164 | 0,51 | Phytol |
| 9 | 35,911 | 1,81 | (Z,Z)-9,12-Octadecadienoic acid |
| 10 | 36,191 | 6,68 | (Z,Z,Z)-9,12,15-Octadecatrien-1-ol |
| 11 | 36,772 | 0,60 | Octadecanoic acid |
| 12 | 37,296 | 0,30 | Buthyl hexadecanoate |
| 13 | 45,261 | 0,25 | Vitamin E |
| 14 | 46,569 | 1,07 | Campesterol |
| 15 | 47,015 | 0,55 | Stigmasterol |
| 16 | 47,866 | 4,19 | -Sitosterol |
c. Thành phần hoá học các chất dễ bay hơi trong dịch chiết EtOAc
Bảng 3.10. Thành phần hoá học các chất dễ bay hơi của cỏ sữa lá nhỏ trong dịch chiết EtOAc
| STT | Thời gian lưu (phút) | % Diện tích pic | Tên hợp chất |
|---|---|---|---|
| 1 | 7,088 | 1,14 | Benzaldehyde |
| 2 | 8,437 | 0,54 | Benzyl Alcohol |
| 3 | 11,680 | 2,33 | 1,2-Benzenediol |
| 4 | 14,425 | 0,74 | 2-Methoxy-4-vinylphenol |
| 5 | 15,961 | 54,01 | 1,2,3-Benzenetriol |
| 6 | 19,349 | 1,38 | Benzoic acid, 4-hydroxy- |
| 7 | 28,855 | 21,31 | Benzoic acid, 3,4,5-trihydroxy-, methyl ester |
| 8 | 30,806 | 0,68 | n-Hexadecanoic acid |
d. Thành phần hoá học các chất dễ bay hơi trong dịch chiết nước
Bảng 3.11. Thành phần hoá học các chất dễ bay hơi của cỏ sữa lá nhỏ trong dịch chiết nước
| STT | Thời gian lưu (phút) | % Diện tích pic | Tên hợp chất |
|---|---|---|---|
| 1 | 7,052 | 1,54 | Benzaldehyde |
| 2 | 8,417 | 1,00 | Benzyl Alcohol |
| 3 | 14,430 | 0,64 | 2-Methoxy-4-vinylphenol |
| 4 | 15,935 | 48,21 | 1,2,3-Benzenetriol |
| 5 | 18,986 | 6,78 | 1,6-anhydro–D-Glucopyranose |
| 6 | 28,730 | 1,46 | Benzoic acid, 3,4,5-trihydroxy-, methyl ester |
| 7 | 30,012 | 0,49 | Methyl hexadecanoate |
| 8 | 30,816 | 1,82 | n-Hexadecanoic acid |
| 9 | 36,031 | 0,87 | (Z,Z,Z)-9,12,15-Octadecatrienoic acid |
| 10 | 40,643 | 2,46 | Arbutin |
3.3.4. Phân lập flavonoid từ cây cỏ sữa lá nhỏ
Cao ethyl acetate được phân lập trên cột silica gel pha thường với hệ dung môi CH2Cl2:CH3OH với độ phân cực tăng dần 50:1 (v/v, 500 ml), 20:1 (v/v, 500 ml), 10:1 (v/v, 500 ml), 5:1 (v/v, 500 ml) và 2:1 (v/v, 500 ml). Sau khi loại dung môi dưới áp suất giảm được các phân đoạn tương ứng là ET – E1 (600mg), ET – E2 (520mg), ET – E3 (120mg), ET – E4 (210mg), ET – E5 (110mg). Phân đoạn ET – E4 được phân lập trên cột nhồi hạt silica gel pha đảo RP-18 có chiều dài 60 cm với hệ dung môi MeOH:H2O (2:3, v/v) được lắp vào máy hứng với tốc độ hứng 0,5 ml/phút. Sau khi máy chạy được 100 phân đoạn, dừng máy kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng. Nhận thấy phân đoạn 35 và 36 có một vết màu vàng khá tròn nên gộp chung, loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 35mg ET – E4A. Tinh chế lại trên cột sephadex LH – 20 với hệ dung môi MeOH:H2O (1:1, v/v) thu được 20 mg hợp chất ET1.
Quy trình phân lập được tóm tắt theo Hình 3.2.
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập flavonoid tinh khiết
3.3.5. Nhận dạng hợp chất phân lập được
Hợp chất ET1 được phân lập dưới dạng bột màu vàng cho thấy đây cũng là một hợp chất flavon. Phổ 1H-NMR của hợp chất ET1 xuất hiện 2 tín hiệu điển hình của hai proton C-6 và C-8 của vòng A tại δ 6,22 (brs) và 6,39 (brs). Ba tín hiệu proton của vòng thơm tương tác hệ ABX xuất hiện tại δ 7,36 (brs), 7,32 (d, J = 7,5 Hz) và 6,93 (d, J = 7,5 Hz) chứng tỏ vòng B đã thế các vị trí C-1′, C-3′, C-4′. Thêm vào đó, tín hiệu proton của đơn vị đường xuất hiện tại δ 5,37 (brs) và một nhóm methyl tại δ 0,96 (d, J = 6,0 Hz) gợi ý đây là một phân tử đường rhamnose. Như vậy, sơ bộ nhận định đây là hợp chất quercitrin.
Bảng 3.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất ET1
| C | *δC | δCa,b | DEPT | δHa, c Mult (J= Hz) |
|---|---|---|---|---|
| Aglycon | ||||
| 2 | 157,2 | 159,3 | C | – |
| 3 | 134,2 | 136,2 | C | – |
| 4 | 177,7 | 179,6 | C | – |
| 5 | 161,3 | 163,2 | C | – |
| 6 | 98,6 | 99,9 | CH | 6,22 (brs) |
| 7 | 164,1 | 165,9 | C | – |
| 8 | 93,6 | 94,8 | CH | 6,39 (brs) |
| 9 | 156,4 | 158,5 | C | – |
| 10 | 104,0 | 105,9 | C | – |
| 1′ | 120,7 | 123,0 | C | – |
| 2′ | 115,4 | 116,4 | CH | 7,36 (brs) |
| 3′ | 145,1 | 146,4 | C | – |
| 4′ | 148,4 | 149,8 | C | – |
| 5′ | 115,6 | 117,0 | CH | 6,93 (d; 7,5) |
| 6′ | 121,1 | 122,9 | CH | 7,32 (d; 7,5) |
| 3-O-rham | ||||
| 1′′ | 101,8 | 103,5 | CH | 5,37 (brs) |
| 2′′ | 70,3 | 72,0 | CH | 4,24 (brs) |
| 3′′ | 70,5 | 72,1 | CH | 3,77 (brd, 8,0) |
| 4′′ | 71,2 | 73,3 | CH | 3,36 (dd; 8,0; 9,5) |
| 5′′ | 70,0 | 71,9 | CH | 3,44 (m) |
| 6′′ | 17,4 | 17,6 | CH3 | 0.96 (d; 6,0) |
Hình 3.3. Cấu trúc hoá học của hợp chất ET1
Trên phổ 13C-NMR và DEPT xuất hiện tín hiệu của 21 carbon, ngoài 15 carbon thuộc khung quercetin (bảng 3.13), còn lại 6 carbon của phân tử đường rhamnose tại δC 103,5; 72,0; 72,1; 73,3; 71,9 và 17,6. Phân tích các dữ kiện phổ thu được và so sánh dữ liệu phổ của hợp chất quercitrin [38], cùng với kết quả phổ khối lượng ESI-MS tại m/z 447,36 [M-H]– tương ứng với công thức phân tử C21H20O11 (M = 448) giúp khẳng định rằng hợp chất ET1 chính là quercitrin (Quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside).
3.4. THẢO LUẬN
3.4.1. Về đối tượng nghiên cứu
Cây cỏ sữa lá nhỏ mọc rải rác ở nhiều vùng miền nước ta, vùng nhiệt đới châu Á và một số nước vùng Nam Mỹ. Nghiên cứu ở Việt Nam về thành phần hoá học, tác dụng hạ đường huyết của cỏ sữa lá nhỏ còn rất hạn chế cho nên đề tài lựa chọn cây này làm đối tượng nghiên cứu.
Nhằm thuận lợi cho quá trình thực nghiệm, đề tài tiến hành khảo sát cây cỏ sữa lá nhỏ mọc ở khu vực Thăng Bình – Quảng Nam. Đồng thời, chưa có công trình nào ở Việt Nam nghiên cứu về cây cỏ sữa lá nhỏ ở khu vực này.
Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy cây cỏ sữa lá nhỏ ở vùng khảo sát có tác dụng hạ đường huyết nhưng có sự khác biệt về thành phần hoá học so với cây cỏ sữa lá nhỏ mọc ở một số nơi khác.
3.4.2. Về các thông số hoá lý của cỏ sữa lá nhỏ
Độ ẩm trung bình và độ tro toàn phần trung bình của mẫu cỏ sữa lá nhỏ nghiên cứu lần lượt là 9,64% và 7,82%. Với độ ẩm này, nguyên liệu có độ ổn định tốt, không bị mốc hay thay đổi về mặt cảm quan trong suốt quá trình thử nghiệm của tác giả.
Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) giúp tác giả xác định được hàm lượng kim loại nặng trong mẫu cỏ sữa lá nhỏ. Căn cứ quyết định số 46/2007/QD-BYT ngày 19/12/2007 của Bộ trưởng Bộ Y tế thì hàm lượng các kim loại nặng trong mẫu cỏ sữa lá nhỏ nghiên cứu cho phép sử dụng, an toàn, không ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Do đó, cỏ sữa lá nhỏ có thể dùng uống dưới dạng trà.
3.4.3. Về tác dụng hạ đường huyết của cây cỏ sữa lá nhỏ
Đề tài tiến hành đánh giá tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết cỏ sữa lá nhỏ trên mô hình chuột tăng glucose máu thực nghiệm bằng STZ (tiêm màng bụng liều 400 mg/kg thể trọng).
Kết quả nghiên cứu (Bảng 3.5) cho thấy cả bốn dịch chiết trong dung môi ethanol – nước của mẫu cỏ sữa lá nhỏ nghiên cứu đều có tác dụng hạ đường huyết. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng tác dụng hạ đường huyết của cỏ sữa lá nhỏ phụ thuộc vào dung môi chiết. Khi chiết với ethanol 50% thì tác dụng hạ đường huyết mạnh hơn là chiết bằng ethanol 96%, ethanol 80% và chiết bằng nước nóng.
Ngoài ra, kết quả nghiên cứu cũng góp phần làm sáng tỏ kinh nghiệm dân gian dùng cây cỏ sữa lá nhỏ nấu để uống điều trị tiểu đường.
Để nghiên cứu sâu hơn, đề tài đã tiến hành chiết phân đoạn với 3 dung môi có độ phân cực tăng dần, xác định thành phần hoá học các chất có trong từng phân đoạn và chọn phân đoạn EtOAC để phân lập chất tinh khiết.
3.4.4. Về thành phần hoá học cây cỏ sữa lá nhỏ
– Định tính các nhóm chất chính
Kết quả Bảng 3.6 cho thấy, cây cỏ sữa lá nhỏ có chứa các nhóm chất flavonoid, saponin, anthranoid, tannin, đường khử, carotenoid, phytosterol, đường khử, acid amin, chất béo và tinh dầu.
Kết quả nghiên cứu của đề tài phù hợp với nghiên cứu của Lee SH và cộng sự [29], Sandeep R.Kane và cộng sự [40], Prasad K và Bisht G. [37].
– Định tính flavonoid
Kết quả định tính bằng phản ứng hoá học đặc trưng của flavonoid trong cây cỏ sữa lá nhỏ cho thấy flavonoid có trong cắn chiết từ CH2Cl2, EtOAc và nước. Kết quả này được giải thích:
+ Flavonoid tồn tại trong dược liệu 2 dạng: dạng aglycon và dạng glycoside có độ phân cực từ yếu đến mạnh, n-hexane là dung môi không phân cực. Do đó, flavonoid không tan trong n-hexane. Vì vậy, phân đoạn A phản ứng âm tính.
+ Cắn các phân đoạn được chiết từ CH2Cl2, EtOAc đều cho phản ứng dương tính với các thuốc thử của flavonoid chứng tỏ flavonoid trong cây cỏ sữa lá nhỏ tồn tại dưới 2 dạng cấu trúc: dạng aglycon tan trong dung môi kém phân cực và dạng glycoside tan tốt trong dung môi phân cực.
+ Cắn từ dịch chiết nước dương tính với các thuốc thử của flavonoid do flavonoid chưa được chiết hết trong các phân đoạn trên
– Thành phần hoá học các chất dễ bay hơi của cỏ sữa lá nhỏ trong các dung môi hữu cơ
Theo nghiên cứu của Đỗ Huy Bích và cộng sự [5] thì cỏ sữa lá nhỏ có chứa tinh dầu với thành phần gồm cymol, carvacrol, limonen, sesquiterpen và acid salicylic. Qua khảo sát sơ bộ cho thấy trong cỏ sữa lá nhỏ có chứa tinh dầu.
Kết quả phân tích bằng sắc ký khí ghép khối phổ (Bảng 3.8, Bảng 3.9, Bảng 3.10 và Bảng 3.11) cho thấy trong cao chiết n-hexane, cao chiết CH2Cl2, cao chiết EtOAc và cao chiết nước của cỏ sữa lá nhỏ đều chứa acid hữu cơ và ester của acid hữu cơ, đặc biệt là n-hexandecanoic acid. Hợp chất này là acid béo nên chiết được nhiều trong phân đoạn n-hexane và CH2Cl2. Trong nghiên cứu đã công bố năm 2011, Prasad K và Bisht G. [37] xác định được thành phần chính của tinh dầu trong cao chiết n-hexane và CH2Cl2 phần trên mặt đất của cỏ sữa lá nhỏ là acid n-hexadecanoic (33,03%), phytol (10,36%) và acid tetradecanoic (6,58%). Các hợp chất này đều được luận văn xác định có trong các phân đoạn chiết tương tự bằng GC-MS. Thực nghiệm cho thấy cỏ sữa lá nhỏ có chứa-Sitosterol trong cao chiết n-hexane và CH2Cl2 với hàm lượng tương ứng là 7,05% và 4,19%. Đây là hợp chất có hoạt tính sinh học, tác dụng là giảm mỡ máu và điều hòa chuyển hóa cholesterol trong máu.
Bên cạnh các acid hữu cơ, ester của acid hữu cơ thì kết quả Bảng 3.9, Bảng 3.10 cho thấy dịch chiết CH2Cl2 và dịch chiết EtOAc của cỏ sữa lá nhỏ có chứa lượng lớn polyphenol, phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Khoa Hạ Mai và cộng sự [11], Nguyễn Xuân Hải và cộng sự [14], Prasad K và Bisht G. [37]. Thành phần polyphenol trong thực vật đã được các nhà khoa học chứng minh có khả năng ức chế men α-glucosidase ở tế bào biểu mô ruột non, giúp hạn chế tăng glucose trong máu sau ăn. Ngoài ra, hoạt chất arbutin được phát hiện trong dịch chiết nước của cỏ sữa lá nhỏ. Cấu tử này có hoạt tính ức chế hoạt động của melanocyte trong kích thích sản xuất melanin nên có tác dụng làm giảm mức độ sạm da sau khi tiếp xúc với tia cực tím, làm đều màu da, trị nám da, trị tàn nhang. Vì vậy, arbutin có mặt trong hầu hết các mỹ phẩm chăm sóc da và làm đẹp.
– Chiết xuất, phân lập và nhận dạng chất
Để phân lập hợp chất từ cây cỏ sữa lá nhỏ, đề tài tiến hành chiết xuất dịch chiết bằng dung môi ethanol 50% theo phương pháp ngâm lạnh. Dịch chiết toàn phần được phân tán vào nước và chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexane, CH2Cl2, EtOAc.
Qua kết quả định tính và tham khảo các kết quả nghiên cứu đã công bố, đề tài định hướng phân lập flavonoid từ cắn của dịch chiết EtOAc. Từ cắn này đã phân lập và xác định được cấu trúc của quercitrin (Quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside).
Theo nghiên cứu của T. Hoang Nguyen Vo và cộng sự [21], quercitrin cùng với các hợp chất tannin, terpenoid và flavonoid khác có tác dụng gắn kết với 4 loại protein: 11β-HSD, glutamine-fructose-6-phos-phate amidotransferase, protein-tyrosine phosphatase 1B, sirtuin-6 or mono-ADP ribosyltransferase-sirtuin-6. Các protein này có tác dụng giảm đường huyết và là đối tượng tiềm năng trong điều trị đái tháo đường type 2. Vì vậy, quercitrin được cho là đối tượng tiềm năng trong điều trị đái tháo đường.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Từ kết quả nghiên cứu cây cỏ sữa lá nhỏ thu hái tại Thăng Bình – Quảng Nam vào tháng 05 năm 2016 rút ra những kết luận sau:
– Về chỉ tiêu hoá lý:
+ Độ ẩm trung bình: 9,64%
+ Độ tro toàn phần trung bình: 7,82%
+ Hàm lượng các kim loại nặng (Pb, Hg, As, Cd) rất thấp, không ảnh hưởng đến sức khoẻ người dùng.
– Về tác dụng hạ đường huyết:
+ Cao chiết từ cây cỏ sữa lá nhỏ ở liều nghiên cứu có tác dụng hạ đường huyết trên mô hình chuột tăng đường huyết thực nghiệm bằng STZ (tiêm màng bụng liều 400 mg/kg thể trọng). Trong đó cao chiết ethanol 50% có tác dụng mạnh hơn các cao chiết ethanol 80%, ethanol 96% và cao chiết nước.
– Về thành phần hoá học:
+ Đã sơ bộ xác định trong cây cỏ sữa lá nhỏ có các thành phần: flavonoid, saponin, anthranoid, tannin, đường khử, carotenoid, phytosterol, acid amin, chất béo và tinh dầu.
+ Flavonoid có trong dịch chiết các phân đoạn dichloromethane và ethyl acetate. Khi định tính flavonoid bằng phản ứng hoá học với các thuốc thử đặc trưng cho thấy cắn ethyl acetate cho phản ứng rõ rệt.
+ Đã định danh được một số cấu tử dễ bay hơi có trong dịch chiết các phân đoạn bằng GC-MS.
+ Đã phân lập được 1 flavonoid tinh khiết. Dựa vào số liệu phổ MS và NMR, kết hợp so sánh với tài liệu đã công bố xác định được chất đó là quercitrin (Quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside).
2. Kiến nghị
Tiếp tục phân lập, tinh chế, xác định cấu trúc, thử hoạt tính hạ đường huyết các chất tinh chế được trong cây cỏ sữa lá nhỏ để từ đó có thể ứng dụng dược liệu này trên lâm sàng trong phòng, điều trị bệnh tiểu đường.
E:\DỮ LIỆU COP CỦA CHỊ YẾN\DAI HOC DA NANG\HOA HUU CO\NGUYEN THI THU\SAU BAO VE
